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超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（WST-1法）說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動,，請注意并嚴格按照該說明書操作,。

貨號：BC5165

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1,、 試劑二：使用前先使用掌上離心機離心至管底再吹打混勻,；

2、 試劑二工作液：根據(jù)樣本數(shù)量按試劑二：蒸餾水=5μL：245μL（共250μL,，約12S）的比例配制試劑二工作液,，現(xiàn)用現(xiàn)配；

3,、 試劑四工作液：根據(jù)樣本量按試劑四：蒸餾水=20μL：180μL（共200μL，約20T）的比例配制試劑四工作液,，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,，催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成H₂O₂和O₂,。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H₂O₂主要生成酶,，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

通過黃*呤及黃*呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O₂^-),，O₂^-可與WST-1反應生成水溶性黃色甲臜,，后者在450nm處有吸收峰；SOD可清除O₂^-,，從而抑制了甲臜的形成,；反應液黃色越深，說明SOD活性愈低,，反之活性越高,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀,、臺式離心機,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、電子天平,、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板,、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

1. 細菌或培養(yǎng)細胞樣本：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）=500-1000:1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W,，超聲3s，間隔10s,，重復30次）,，8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

2. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1:5-10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿,；8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測。

3. 血清（漿）樣本：直接檢測,，若有渾濁可離心后取上清進行測定。

二,、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm,，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2. 測定前將試劑一,、試劑三和試劑四工作液37℃水浴5min以上。

3. 加樣表（按順序在EP管或96孔板中加入下列試劑）

充分混勻,，37℃水浴30min后,，450nm處測定各管吸光值A,。分別記為A測定、A對照,、A1空白,、A2空白，計算ΔA測定=A測定-A對照,，ΔA空白=A1空白-A2空白。（空白管1和空白管2各只需做1~2管,；每個樣本有一個對照管）

三,、SOD活性計算

1、抑制百分率的計算

抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%

盡量使樣本的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi),，越靠近50%越準確。如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%,，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定,。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當稀釋樣本,；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度比較高的待測樣本或者提高加樣表中的樣本量,，但需相應減少測定管和對照管中蒸餾水的體積。

2,、SOD酶活性單位：在上述黃*呤氧化酶偶聯(lián)反應體系中抑制百分率為50%時，反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位,。

3、SOD酶活性計算：

（1）血清（漿）SOD活性（U/mL）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷V樣×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×F

（2）組織,、細菌或培養(yǎng)細胞SOD活力計算：

a.按樣本蛋白濃度計算

SOD活性（U/mg prot）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷(V樣×Cpr)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F

b.按樣本質(zhì)量計算

SOD活性（U/g 質(zhì)量）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷(W×V樣÷V樣總)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F

c.按細菌或細胞數(shù)量計算

SOD 活力（U/10⁴ cell）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷(N×V樣÷V樣總)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷N×F

V反總：反應總體積,，0.2mL,；V樣：加入反應體系中的樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積1mL；Cpr：蛋白樣本濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；N：細胞或細菌總數(shù)，以10⁴計,；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1,、 樣本和試劑二工作液使用時在冰上放置。

2,、 樣本較多時,，可按表格配制測定管工作液和對照管工作液（包含試劑一,、（試劑二工作液）、試劑三,、蒸餾水）,，試劑四工作液必須最后加入。

實驗實例：

1,、 取0.1g大鼠肝臟加入1mL提取液進行勻漿研磨,，取上清稀釋50倍,，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.419-0.047=0.372，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707,，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=47.38%，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

SOD活性（U/g 質(zhì)量）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =4502.09 U/g 質(zhì)量,。

2、 取0.1g綠蘿葉片加入1mL提取液進行勻漿研磨,，取上清稀釋3倍,，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.417-0.108=0.309，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707,，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=56.29%,，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

SOD活性（U/g 質(zhì)量）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =386.34 U/g 質(zhì)量,。

3,、 450×10⁴個Hela細胞，加入1mL提取液進行勻漿研磨,，取上清按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.417-0.053=0.364，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707,，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=48.51%，按細胞數(shù)量計算酶活得：

SOD活性（U/10⁴ cell）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷N×F =0.021 U/10⁴ cell,。

4,、 取50μL人血清按照測定步驟操作（同時減少加樣表中蒸餾水體積）,，用96孔板測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.889-0.418=0.471，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707,，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=33.38%,，按血清（漿）體積計算酶活得：

血清（漿）SOD活性（U/mL）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷V樣×F =2.004 U/mL

參考文獻：

[1] Peskin A V, Winterbourn C C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1) [J]. Clinica chimica acta, 2000, 293(1-2):157-166.

[2] Hou Z, Zhao L, Wang Y, et al. Purification and characterization of superoxide dismutases from sea buckthorn and chestnut rose[J]. Journal of food science, 2019, 84(4): 746-753.

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