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β-羥丁酸（β-HB）含量檢測(cè)試劑盒（WST法）說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5085

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑二：臨用前取一支加入600μL蒸餾水,，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃可保存3周,。避免反復(fù)凍融,。

2、 試劑三：臨用前取一支加入400μL蒸餾水,，充分溶解,。用不完的試劑分裝后-20℃保存，可以保存2周,。避免反復(fù)凍融,。（試劑三由于不便保存，故多給一支）

3,、 標(biāo)準(zhǔn)品：8mg 3-羥基丁酸鈉,。臨用前加入980μL蒸餾水，充分溶解,，即8mg/mL 3-羥基丁酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液,。4℃保存1個(gè)月。

4,、 工作液配制：臨用前根據(jù)試驗(yàn)所需量將試劑一,、試劑二、試劑三按照170:8:2（共180μL,，1T的量）的比例配成工作液,，充分混勻，置于37℃保溫15min（此步驟不可省略）,，現(xiàn)用現(xiàn)配,，工作液在4h內(nèi)用完。

產(chǎn)品說(shuō)明：

β-羥丁酸（β-HB），在嚴(yán)重酸中毒患者體內(nèi),，由于酸中毒使患者體內(nèi)NADH生成增加,，進(jìn)而促使β-羥丁酸與乙酰乙酸的比值自正常的2:1提高至16:1。β-羥丁酸在檢測(cè)糖尿病酮癥酸中毒診斷,、治療中有重要意義,，對(duì)糖尿病的早期診斷也有重要意義。本試劑盒適用于血清,、血漿,、尿液等樣本

在pH8.8和37℃條件下，β-HB在β-羥丁酸脫氫酶（HBDH）催化下發(fā)生反應(yīng),，同時(shí)NAD⁺被還原成NADH,；在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應(yīng),，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰,。通過(guò)檢測(cè)450nm下波長(zhǎng)變化,，可計(jì)算出β-HB的含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè),。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī),、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

適用樣本

血清、血漿,、尿液等樣本,，直接檢測(cè)即可，若溶液有渾濁可離心后進(jìn)行測(cè)定

二,、測(cè)定步驟

1,、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將8mg/mL 3-羥基丁酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液,，用蒸餾水稀釋至0.125,、0.0625、0.03125、0.015625,、0.0078125mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待用,。

3、 按下表步驟加樣：

三,、β-HB含量計(jì)算

1,、 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以β-HB標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL）,，以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到線性回歸方程y=kx+b，將ΔA測(cè)定帶入方程求得x（mg/mL）,。

2,、 計(jì)算公式

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

β-HB含量（μmol /mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷126.09×1000=7.931x÷Cpr

（2）按照血清（漿）體積計(jì)算

β-HB含量（μmol /mL）=x×V樣÷V樣÷126.09×1000=7.931x

V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，20 μL=0.02 mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；V樣總：加入提取液體積,，1 mL,；126.09：β-羥基丁酸鈉的分子量，mg/mmol,；1000：1mmol=1000μmol,。

注意事項(xiàng)：

1、顯色完成后,，請(qǐng)?jiān)?/span>10 min之內(nèi)完成檢測(cè),。

2、如果ΔA測(cè)定低于或超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光值范圍,，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測(cè)定,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取20μL 牛血清按上述步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用96孔板測(cè)定后進(jìn)行計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.455-0.082=0.373，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.4913x+0.0043,，得x=0.750,。計(jì)算

β-HB含量（μmol /mL）=7.931x=5.948 μmol /mL

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