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乙酰乙酸（AcAc）含量檢測試劑盒（WST法）說明書

                                          微量法

貨號：BC5075

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1,、 試劑二：臨用前取一支加入600μL蒸餾水，充分溶解,。用不完的試劑分裝后-20℃可保存3周,。避免反復(fù)凍融,。

2、 試劑三：臨用前取一支加入400μL蒸餾水,，充分溶解,。用不完的試劑分裝后-20℃保存，可以保存2周,。避免反復(fù)凍融,。（試劑三由于不便保存，故多給一支）

3,、 標(biāo)準(zhǔn)品：8mg 乙酰乙酸鋰,。臨用前加入950μL蒸餾水，充分溶解,，即8mg/mL 乙酰乙酸鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液,。-20℃分裝保存4周。

4,、 工作液配制：臨用前根據(jù)試驗(yàn)所需量將試劑一,、試劑二、試劑三按照170:8:2（180μL,，1T的量）的比例配成工作液,，充分混勻，置于37℃保溫15min（此步驟不可省略）,，現(xiàn)用現(xiàn)配,，工作液在4h內(nèi)用完。

產(chǎn)品說明：

乙酰乙酸(AcAc)是酮體的重要成分之一,，約占正常人酮體總量20%,，是脂肪酸通過氧化產(chǎn)生的,是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸。正常含量的乙酰乙酸對人體無害,，糖尿病患者由于糖的利用降低,，或饑餓時(shí)由于糖的代謝障礙，大量動(dòng)用脂肪,，乙酰乙酸的量都會積累,。乙酰乙酸即可轉(zhuǎn)化成丙酮，也可以轉(zhuǎn)化成β-羥丁酸,。

在檢測中,，乙酰乙酸通過偶聯(lián)酶反應(yīng)產(chǎn)生450nm吸收峰的產(chǎn)物，與存在的乙酰乙酸成比例,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、低溫離心機(jī),、超聲波細(xì)胞破碎儀,、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板,、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織樣本的制備：按照質(zhì)量（g）: 提取液體積(mL)為1: 5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織,，加入1mL提取液）加入提取液,，冰浴勻漿后于4℃，12000 g離心10 min后取上清待測,。

2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率200W,，超聲3s，間隔10s,，重復(fù)30次）,；12000 g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

3、血清（漿）等其它液體樣本：直接測定,。

二,、測定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,，調(diào)節(jié)波長至450 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將80mg/mL 乙酰乙酸鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液,，用蒸餾水稀釋至0.25、0.2,、0.15,、0.1、0.05,、0.025,、0.0125,、0.00625 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

3,、 按下表步驟加樣：

三、AcAc含量計(jì)算

1,、 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以乙酰乙酸鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x,，mg/mL），以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到線性回歸方程y=kx+b,，將ΔA測定帶入方程求得x（mg/mL）。

2,、 計(jì)算公式

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

AcAc含量（μmol/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷108.02×1000÷108.02=9.258x÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

AcAc含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×1000÷108.02=9.258x÷W

（3）按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算

AcAc含量（μmol/10⁴ cell）=x×V樣÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷108.02×1000=9.258x÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照血清（漿）體積計(jì)算

AcAc含量（μmol/mL）=x×V樣÷V樣÷108.02=9.258x

V樣：反應(yīng)中加入樣本體積,，20 μL=0.02 mL；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；細(xì)胞數(shù)量：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，以10⁴計(jì)；V樣總：加入提取液體積,，1 mL,；108.02：乙酰乙酸鋰分子量，mg/mmol,。

注意事項(xiàng)：

1,、顯色完成后，請?jiān)?/span>15min之內(nèi)完成檢測,。

2,、如果測定吸光值低于或超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取20 μL 牛血清按上述步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，用96孔板測定后進(jìn)行計(jì)算ΔA測定=A空白-（A測定-A對照）=0.802-（0.837-0.076）=0.041,，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.2259x+0.0145，計(jì)算x=0.117,。計(jì)算

AcAc含量（μmol/mL）=9.258x=1.082μmol/mL

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