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α-甘露糖苷酶(α-man)活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5045

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑二：臨用前每支加入0.5mL 試劑四溶解，溶解后的試劑在-20℃分裝保存,，可以保存4周,。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：5mmol/L的對(duì)硝基 苯*標(biāo)準(zhǔn)液,。

產(chǎn)品說(shuō)明：

α-man分布廣泛,、種類(lèi)繁多，在真核生物胞質(zhì),、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),、高爾基體、溶酶體中都有發(fā)現(xiàn),，不同種類(lèi),、功能的α-man共同參與N-聚糖的修飾過(guò)程。

α-man和特定底物發(fā)生反應(yīng),，其生成物在405nm處有特征吸收峰,，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出α-man活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè),。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī),、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋,、勻漿器/研缽、可調(diào)式移液器,、微量玻璃比色皿/96孔板,、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1 g組織,，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿,，然后12000 g,，4℃，離心10 min,，取上清置于冰上待測(cè),。

2、細(xì)胞或細(xì)菌：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率200 W,，超聲3秒，間隔7秒,，總時(shí)間3 min）,；然后15000 g，4℃,，離心10 min,，取上清置于冰上待測(cè)。

3,、液體：直接檢測(cè),。若有渾濁可以離心后測(cè)定。

二,、測(cè)定步驟

1,、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405 nm,，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零,。

2、 將5mmol/L的對(duì)-硝基 苯*標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.625,、0.3125,、0.15625、0.078,、0.039,、0.0195、0.01 mmol/L

的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用,。

3,、 操作表：(在1.5 mL離心管或者96孔板中)

三、α-甘露糖苷酶活性計(jì)算

1,、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸,，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y＝kx+b,，將ΔA帶入方程得到x（mmol/L，即μmol/mL）,。

2,、 α-甘露糖苷酶活性的計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1 μmol對(duì)-硝基 苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T×F= x×0.1÷ Cpr×F

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每g樣本每分鐘產(chǎn)生1 μmol對(duì)-硝基 苯*為1個(gè)酶活力單位,。

α-甘露糖苷酶酶活（U/g質(zhì)量）=x×V樣÷（W÷V樣÷V提?。?/span>÷T×F= x×0.1÷W×F

（3）按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 μmol 對(duì)-硝基 苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/10⁴ cell）= x×V樣÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V提?。?/span>÷T×F
= x×0.1÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）×F

（4）按液體體積計(jì)算

酶活定義：每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1 μmol對(duì)-硝 基苯*為1個(gè)酶活力單位,。

α-甘露糖苷酶酶活（U/mL）＝x×V樣÷V樣÷T×F= x×0.1×F

V提取：提取液體積,，1 mL,；V樣：加入的樣本體積，0.025 mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定,；W：樣本質(zhì)量,，g；T：反應(yīng)時(shí)間,，10 min,； F：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1,、如果測(cè)定吸光值A＞1.5或ΔA＞1,，建議稀釋樣本后再測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù),；如果測(cè)定吸光值較低或接近空白OD值,，建議增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱(chēng)取0.1 g兔子肝臟組織,，加入1 mL提取液,，冰浴勻漿，12000 g,，4℃條件下離心10 min,；取上清置于冰上待測(cè)。使用96孔板按照測(cè)定步驟操作,，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.404-0.309=0.095,，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3642x+ 0.0037，計(jì)算x=0.0669,，按公式計(jì)算活性：

α-甘露糖苷酶酶活（U/g 質(zhì)量）= x×0.1÷W×F = 0.0669 U/g質(zhì)量

2、 稱(chēng)取0.1 g綠蘿葉片,，加入1 mL提取液,，冰浴勻漿，12000 g,，4℃條件下離心10 min,；取上清置于冰上待測(cè)。使用96孔板按照測(cè)定步驟操作,，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.179-0.159=0.02,，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3642x+ 0.0037，計(jì)算x=0.0119,，按公式計(jì)算活性：

α-甘露糖苷酶酶活（U/g 質(zhì)量）= x×0.1÷W×F = 0.0119 U/g質(zhì)量

3,、 用0.025mL牛血清按操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用96孔板按照測(cè)定步驟操作,，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.107- 0.086=0.021,，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3642x+ 0.0037，計(jì)算x=0.0127,，按公式計(jì)算活性：

α-甘露糖苷酶酶活（U/g 質(zhì)量）= x×0.1÷W×F = 0.0127 U/mL

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0360/ BC0365 β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性檢測(cè)試劑盒

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α-甘露糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法 α-甘露糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法