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硝酸還原酶（NR）活性檢測(cè)試劑盒（Griess顯色法）說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC4965

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 誘導(dǎo)液：將誘導(dǎo)劑儲(chǔ)備液用蒸餾水10倍稀釋后使用,，即取10 mL誘導(dǎo)劑儲(chǔ)備液加90 mL蒸餾水，充分混勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用,。

2、 試劑二：加入1mL蒸餾水,，-20℃分裝保存,，可以-20℃保存2周。臨用前用蒸餾水將試劑二稀釋50倍,，備用,，即取10 μL試劑二加入490 μL蒸餾水混勻。

3,、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 μmol/mL亞硝 *準(zhǔn)溶液,。臨用前將用蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋100倍得到0.1 μmol/mL的亞硝 *標(biāo)準(zhǔn)液，備用,。

產(chǎn)品說(shuō)明：

NR（EC 1.7.1.3）廣泛存在于植物中,，是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶，也是誘導(dǎo)酶,，對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響,。NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO₃^ˉ +NADH+H^＋→NO_2ˉ+NAD^＋+H₂O,。在酸性條件下，產(chǎn)生的NO₂^ˉ能夠參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物,，這種紫紅色化合物在540 nm處有吸收峰,，540 nm下吸光值的變化即可表示酶活。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè),。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋,、臺(tái)式離心機(jī),、微量玻璃比色皿/96孔板,、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1,、組織前處理：

（1） 取適量誘導(dǎo)液于燒杯中,，將新鮮標(biāo)本洗凈，濾紙吸干,，放入誘導(dǎo)液中（淹沒(méi)即可）,，避光浸泡2 h，取出樣本,，濾紙吸干后,，-20℃冷凍30 min，取出樣本,，濾紙吸干,。（根據(jù)需要進(jìn)行誘導(dǎo)處理，一般不需要誘導(dǎo)處理,，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有活性則需要進(jìn)行誘導(dǎo)處理）

（2） 按照組織質(zhì)量(g)：提取液體積(mL)為1:5~10的比例(稱取約0.1 g樣本,，加入1 mL提取液)，冰浴研磨,，8000g,，4℃離心10 min，取上清置冰上待測(cè),。

2,、細(xì)胞或細(xì)菌的前處理：

先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi)，棄上清,，按照每500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）。8000g,，4℃離心10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

二,、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、 樣本測(cè)定：

三,、NR活性計(jì)算

NR活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每小時(shí)每mg組織蛋白催化產(chǎn)生1 μmol NO₂^-的量為1個(gè)NR活力單位,。

NR活力（U/mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×V樣本÷（V樣本×Cpr）÷T×F

= 0.2×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷Cpr×F

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：每小時(shí)每g組織催化產(chǎn)生1 μmol NO₂^-的量為1個(gè)NR活力單位。

NR活力（U/g 質(zhì)量）=C標(biāo)準(zhǔn)×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×V樣本÷（W×V樣本÷V提?。?/span>÷T×F

= 0.2×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷W×F

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活定義：每小時(shí)每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌催化產(chǎn)生1 μmol NO₂^-的量為1個(gè)NR活力單位,。

NR活力（U/10⁴ cell）

=C標(biāo)準(zhǔn)×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×V樣本÷（細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量×V樣本÷V提取）÷T×F

= 0.2×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量×F

C標(biāo)準(zhǔn)：亞硝 *標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,，0.1 μmol/mL,；V提取：加入提取液體積,，1 mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；T：反應(yīng)時(shí)間,，0.5 h；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL,；V樣本：加入的樣本體積，0.02 mL,；細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量：以萬(wàn)計(jì),；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 吸光度大于1時(shí),，建議用提取液稀釋樣本,，注意計(jì)算公式中參與計(jì)算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。

2. 嚴(yán)格按照樣本測(cè)定表格列出順序加入試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1 g綠蘿葉片加入1 mL提取液進(jìn)行勻漿研磨,，離心取上清按照測(cè)定步驟操作,，用96孔板測(cè)得A測(cè)定=0.078,、A對(duì)照=0.070,、A標(biāo)準(zhǔn)=0.268、A空白=0.046,，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NR活力（U/g 質(zhì)量）= 0.2×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷W= 0.0721 U/g 質(zhì)量,。

2. 取0.1 g洋桔梗葉片加入1 mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，離心取上清按照測(cè)定步驟操作,，用96孔板測(cè)得A測(cè)定=0.088,、A對(duì)照=0.064、A標(biāo)準(zhǔn)=0.268,、A空白=0.046,，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NR活力（U/g 質(zhì)量）= 0.2×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷W= 0.216 U/g 質(zhì)量。

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0070/BC0075  谷*酸合成酶（GOGAT）活性檢測(cè)試劑盒

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硝酸還原酶（NR）活性檢測(cè)試劑盒 微量法 硝酸還原酶（NR）活性檢測(cè)試劑盒 微量法