目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC5245-100T/96S脂質過氧化物（LPO）含量檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/96S |
| 貨號 | BC5245 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產業(yè),農業(yè),綜合 |
| 主要用途 | 脂質過氧化物（LPO）含量檢測 |
脂質過氧化物（LPO）含量檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC5245
規(guī)格：100T/96S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體110mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體11mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體4mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
稀釋液 | 液體20mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 試劑二：臨用前取1瓶試劑二加入7mL 蒸餾水,，此試劑較難溶,，可以在70℃加熱并劇烈振蕩以促進溶解，或者通過超聲處理以促進溶解,。每次用前需檢查是否有粉劑析出,。用不完的試劑可在2-8℃中保存一個月。
2. 標準品：為1000nmol/mL的標準溶液
產品說明：
脂質過氧化物（lipid hydroperoxide LPO）是不飽和脂肪酸鏈經自由基或活性氧作用后產生的過氧化物。病理情況下,，脂質過氧化反應增強可導致原本低含量的LPO升高,。LPO含量升高會對細胞的結構和功能造成損傷，LPO含量與機體免疫系統(tǒng)和衰老密切相關,。
LPO在酸性條件下加熱產生丙二醛（MDA）,，MDA與硫代巴*妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)縮合,，生成棕紅色物質三甲川（3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二*）,，其最大吸收波長在 532nm，進行比色后可估測樣本中LPO的含量,。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計/酶標儀,、臺式離心機,、水浴鍋、可調式移液器,、研缽/勻漿器/細胞超聲波破碎儀,、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水,。
操作步驟：
一,、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1,、組織：按照樣本質量（g）：提取液體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取
液）加入提取液，冰浴勻漿,；8000g 4℃離心10min,，取上清置冰上待測。
2,、細菌或細胞樣本：收集細菌或細胞到離心管內,，離心后棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000:1 的比例（建議500萬細菌或細胞加入 1mL 提取液）加入提取液,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率200W，超聲 3s,，間隔 7s,，總時間3min），8000g 4℃離心10min,，取上清置冰上待測,。
3,、培養(yǎng)液或其他液體：直接檢測。若溶液渾濁則離心后取上清進行測定,。
二,、測定步驟
1、可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上,，調節(jié)波長至532nm和600nm,，可見分光光度計需用蒸餾水調零。
2,、標準溶液的制備：現(xiàn)標準液為1000nmol/mL的MDA標準溶液,，將標準液用稀釋液稀釋至20、10,、5,、2.5、1.25,、0.625,、0.3125、0.15625nmol/mL備用,，具體稀釋可參考下表,。
序號 | 稀釋前濃度（nmol/mL） | 標準液體積（µL） | 稀釋液體積（µL） | 稀釋后濃度（nmol/mL） |
1 | 1000 | 40 | 960 | 40 |
2 | 40 | 500 | 500 | 20 |
3 | 20 | 500 | 500 | 10 |
4 | 10 | 500 | 500 | 5 |
5 | 5 | 500 | 500 | 2.5 |
6 | 2.5 | 500 | 500 | 1.25 |
7 | 1.25 | 500 | 500 | 0.625 |
8 | 0.625 | 500 | 500 | 0.3125 |
9 | 0.3125 | 500 | 500 | 0.15625 |
備注：實驗中每個標準管需120µL標準溶液。
3,、在EP管中按下表步驟加樣：
試劑名稱 | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
樣本（μL） | 120 | - | - | - |
蒸餾水（μL） | - | 120 | - | - |
標準液（μL） | - | - | 120 | - |
稀釋液（μL） | - | - | - | 120 |
試劑一（μL） | 90 | 90 | 90 | 90 |
試劑二（μL） | 60 | 60 | 60 | 60 |
試劑三（μL） | 30 | 30 | 30 | 30 |
將混合液在 45℃（植物樣本）或100℃（其他樣本）水浴60min 后（標準管在兩個溫度水浴均可）,，置于冰浴中冷卻，8000g,，常溫,，離心 10min。吸取200μL上清液于微量玻璃比色皿或 96 孔板中,，測定各樣本在 532nm和600nm處的吸光度。分別計算 ΔA=（A532測定-A532對照）-（A600測定-A600對照）,，ΔA標準=（A532標準-A532空白）-(A600標準-A600空白）（標準曲線,，空白管和對照管只需做 1-2 次）。
三,、LPO含量的計算
1. 根據標準管的濃度（x,，nmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準）,，建立標準曲線,。根據標準曲線，將ΔA（y,，ΔA）代入公式計算樣本濃度（x,，nmol/mL）
2. 按樣本蛋白質濃度計算
LPO含量（nmol/mg prot）= x×V樣÷（Cpr×V樣）= x÷Cpr
3. 按樣本質量計算
LPO含量（nmol/g 質量）= x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）= x÷W
4. 按細菌/細胞數(shù)量計算
LPO含量（nmol/104cell）= x×V樣÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量（萬個））= x÷細胞數(shù)量（萬個）
5. 按照液體樣本體積計算
LPO含量（nmol/mL）= x
V樣：加入樣本體積,，0.12mL，V樣總：提取液體積,，1mL,；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL,；W：樣本質量,，g。
注意事項：
1. 待測液如果有密集小氣泡,，建議靜置20min左右等待氣泡消失再測,，以免影響測定結果，如果有少量氣泡可以通過低速離心或輕磕等方式來消除,。
2. 待測液如果尚未澄清,，可吸取上清液后再次離心。
3. 為防止水浴60min過程中水分散失,，建議使用螺旋管或用封口膜給EP管纏口,。
4. 如果用高溫助溶試劑二,，需要待其冷卻至室溫后再使用,。
5. 如果測定吸光值過低或接近空白,，適當延長反應時間或加大樣本量后,，重新測定,。如果吸光值過大或超過檢測范圍（A532＞1.5或者ΔA＞1.5時），建議將樣本適當稀釋后進行測定,。注意同步修改計算公式,。
實驗實例：
1. 稱取0.1192 g綠蘿，加入1mL提取液,，冰浴勻漿,，8000g 4℃離心10min,，取上清置冰上待測,，之后按照測定步驟操作,，使用96孔板測定并進行計算A532測定= 0.139,，A532對照= 0.042,，A600測定= 0.054，A600對照= 0.039,，?A=0.082,，將?A代入標曲公式y = 0.0218x - 0.0054,，R2=0.9997，得出x=4.009,，按樣本質量計算得：
LPO含量（nmol/g 質量）= x÷W = 33.63 nmol/g 質量,。
2. 稱取0.1209g大鼠心臟,，加入1mL提取液,，冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min,，取上清置冰上待測,，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測定并進行計算A532測定 = 0.097,，A532對照 = 0.047,，A600測定 =0.065，A600對照 = 0.042,，?A=0.027,，將?A代入標曲公式y = 0.0525x - 0.0007，R2=0.9993,，得出x=0.528,，按樣本質量計算得：
LPO含量（nmol/g 質量）= x÷W = 4.367 nmol/g 質量。
參考文獻：
Hiroshi Ohkawa, Nobuko Ohishi, Kunio Yagi, Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction[J], Analytical Biochemistry,1979.
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脂質過氧化物（LPO）含量檢測試劑盒 微量法 脂質過氧化物（LPO）含量檢測試劑盒 微量法
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