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超氧化物歧化酶（SOD）分型活性檢測試劑盒（WST法）說明書

（測Cu-Zn、Mn,、總SOD活性）

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動,，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操

貨號：BC5255

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑二：使用前先使用掌上離心機離心至管底再吹打混勻；

2,、 試劑二工作液：根據(jù)樣本數(shù)量按試劑二：蒸餾水=5μL：245μL（共250μL,，可做約12個Cu-Zn-SOD樣本或6個Mn-SOD樣本）的比例配制試劑二工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配,；

3,、 試劑四工作液：根據(jù)樣本量按試劑四：蒸餾水=20μL：180μL（共200μL,，約20T）的比例配制試劑四工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

產(chǎn)品說明：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，根據(jù)其輔基結(jié)合金屬離子的不同,，可分為銅鋅SOD、錳SOD等類型,，銅鋅SOD主要位于細(xì)胞質(zhì),，錳SOD主要位于線粒體。SOD催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用,，生成H₂O₂和O₂,。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H₂O₂主要生成酶,，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用,。

通過黃*呤及黃*呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O₂^-)，O₂^-可與WST-1反應(yīng)生成水溶性黃色甲臜,，后者在450nm處有吸收峰,；SOD可清除O₂^-，從而抑制了甲臜的形成,；反應(yīng)液黃色越深,，說明SOD活性愈低，反之活性越高,。樣本經(jīng)過處理后銅鋅SOD活性不變,，錳SOD活性喪失。通過測定總SOD活性和銅鋅SOD活性,，可計算得到錳SOD活性,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、臺式離心機、漩渦混勻儀/振蕩器,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、電子天平、可調(diào)式移液器,、微量玻璃比色皿/96孔板,、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一,、樣本處理

1. 總SOD活性測定

1) 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）=500-1000:1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液一）超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率200W,，超聲3s，間隔10s,，重復(fù)30次）,，8000g 4℃離心10min，取全部上清,，部分用于測定總SOD活性,。

2) 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液一體積（mL）為1:5-10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液一）進(jìn)行冰浴勻漿,；8000g 4℃離心10min,，取全部上清，部分用于測定總SOD活性,。

3) 血清（漿）樣本：直接用于測定總SOD活性,，若有渾濁可離心后取上清進(jìn)行測定。

2. 銅鋅SOD活性測定

1) 取上一步提取得到的上清,，按照上清體積（mL）：提取液二體積（mL）=2:3的比例（建議取0.2mL上清加入0.3mL提取液二）混合,，震蕩混勻1min，4000g 4℃離心10min,，取最上層的上清用于測定銅鋅SOD活性，此上清即樣本處理上清,，上清中銅鋅SOD活性不變,，錳SOD活性喪失。

    注：混合液離心后分為3層,，取最上層溶液測定即可,。

2) 按照蒸餾水體積（mL）：提取液二體積（mL）=2:3的比例（建議取0.2mL蒸餾水加入0.3mL提取液二）混合，震蕩混勻1min,，4000g 4℃離心10min,，取最上層的上清用于測定銅鋅SOD活性的空白管，此上清即蒸餾水處理上清,。

二,、測定步驟

1. 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm,，分光光度計蒸餾水調(diào)零,。

2. 測定前將試劑一、試劑三和試劑四工作液37℃水浴5min以上。

3. 加樣表（按順序在EP管或96孔板中加入下列試劑）

充分混勻,，37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)30min后,，置于微量玻璃比色皿/96孔板測定450nm下的吸光度，空白管1,、空白管2,、空白管3和空白管4只需做1-2次，每個樣本測定管需設(shè)置一個對照管,。

總SOD的記為A1測定,、A1對照、A1空白,、A2空白,，計算ΔA1測定=A1測定-A1對照，ΔA1空白=A1空白-A2空白,。

銅鋅SOD的記為A2測定,、A2對照、A3空白,、A4空白,，計算ΔA2測定=A2測定-A2對照，ΔA3空白=A3空白-A4空白,。

三,、SOD活性計算

1、抑制百分率的計算

總SOD抑制百分率=(ΔA1空白-ΔA1測定) ÷ΔA1空白×100%

銅鋅SOD抑制百分率=(ΔA3空白-ΔA2測定) ÷ΔA3空白×100%

盡量使樣本的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi),，越靠近50%越準(zhǔn)確,。如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定,。如果測定出來的抑制百分率偏高,，則需適當(dāng)稀釋樣本；如果測定出來的抑制百分率偏低,，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測樣本或者提高加樣表中的樣本量,，但需相應(yīng)減少測定管和對照管中蒸餾水的體積。注意同步修改計算公式,。

2,、SOD酶活性單位：在上述黃*呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位,。

3,、SOD酶活性計算：

（1）血清（漿）SOD活性（U/mL）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷V樣×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×F

（2）組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞SOD活力計算：

A按樣本蛋白濃度計算

SOD活性（U/mg prot）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷(V樣×Cpr)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F

B按樣本質(zhì)量計算

SOD活性（U/g 質(zhì)量）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷(W×V樣÷V樣總)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F

C按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

SOD 活力（U/10⁴ cell）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷(500×V樣÷V樣總)×F

=0.02×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F

（3）錳SOD活性=總SOD活性-銅鋅SOD活性

V反總：反應(yīng)總體積,，0.2mL,；V樣：加入反應(yīng)體系中的樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；Cpr：蛋白樣本濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬,；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1,、 樣本和試劑二工作液使用時在冰上放置,。

2、 樣本較多時,，可按表格配制測定管工作液和對照管工作液（包含試劑一,、（試劑二工作液）、試劑三,、蒸餾水）,，試劑四工作液必須最后加入。

3,、 本試劑盒可做48個錳-SOD樣本或者96個銅鋅-SOD樣本,。

實驗實例：

1、 取0.106g黃楊葉片加入1mL提取液一進(jìn)行勻漿研磨,，取上清稀釋10倍,，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA1測定= A1測定-A1對照=0.399-0.088=0.311,，ΔA1空白=A1空白-A2空白=0.801-0.088=0.713,，總SOD

2、 抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=56.381%,；取0.2mL稀釋10倍的上清，加入0.3mL提取液二,，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算ΔA2測定= A2測定-A2對照=0.827-0.086=0.741，ΔA3空白=A3空白-A4空白=1.011-0.081=0.930,，銅鋅SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=20.323%,，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

總SOD活性（U/g 質(zhì)量）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =1219.438 U/g 質(zhì)量

銅鋅SOD活性（U/g 質(zhì)量）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =240.623 U/g 質(zhì)量

錳SOD活性（U/g 質(zhì)量）=1219.438-240.623 =978.815 U/g 質(zhì)量

3、 取0.1104g兔脾臟加入1mL提取液一進(jìn)行勻漿研磨,，取上清稀釋10倍,，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA1測定= A1測定-A1對照=0.348-0.088=0.260，ΔA1空白=A1空白-A2空白=0.801-0.088=0.713,，總SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=63.534%,；取0.2mL稀釋10倍的上清，加入0.3mL提取液二,，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算ΔA2測定= A2測定-A2對照=0.637-0.084=0.553，ΔA3空白=A3空白-A4空白=1.011-0.081=0.930,，銅鋅SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=40.538%,，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

總SOD活性（U/g 質(zhì)量）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =1578.177 U/g 質(zhì)量

銅鋅SOD活性（U/g 質(zhì)量）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =617.514 U/g 質(zhì)量

錳SOD活性（U/g 質(zhì)量）=1578.177-617.514 =960.663 U/g 質(zhì)量

4、 取1000萬細(xì)胞加入1mL提取液一進(jìn)行前處理并按測定步驟操作,，反應(yīng)體系中樣本量加倍,，用96孔板測得計算ΔA1測定= A1測定-A1對照=0.336-0.124=0.212，ΔA1空白=A1空白-A2空白=0.714-0.086=0.628,，總SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=66.242%,；取0.2mL上清，加入0.3mL提取液二,，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算ΔA2測定= A2測定-A2對照=0.525-0.085=0.440，ΔA3空白=A3空白-A4空白=0.982-0.081=0.901,，銅鋅SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=51.165%,，修改計算公式后按細(xì)胞數(shù)量計算酶活得：

總SOD活性（U/10⁴ cell）=0.005×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×F =0.010 U/10⁴ cell

銅鋅SOD活性（U/10⁴ cell）=0.005×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×F =0.005 U/10⁴ cell

錳SOD活性（U/10⁴ cell）=0.010-0.005=0.005 U/10⁴ cell

參考文獻(xiàn)：

[1] Peskin A V, Winterbourn C C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1) [J]. Clinica chimica acta, 2000, 293(1-2):157-166.

[2] Hou Z, Zhao L, Wang Y, et al. Purification and characterization of superoxide dismutases from sea buckthorn and chestnut rose[J]. Journal of food science, 2019, 84(4): 746-753.

[3] Cristiana, F. , Elena, A. and Nina, Z. Superoxide Dismutase: Therapeutic Targets in SOD Related Pathology[J]. Health, 2014, 06(10):975-988.

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