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半胱氨酰亞砜裂解酶（CSL）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5395

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑二：試劑放于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前加入4 mL蒸餾水溶解,，-20℃分裝可保存4周,，避免反復(fù)凍融。

2,、 試劑二工作液：臨用前根據(jù)樣本量將試劑二用蒸餾水稀釋5000倍,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

1、 標(biāo)準(zhǔn)品：20μmol/mL *酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液,。

2,、 0.625μmol/mL*酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的配制：臨用前取30μL的20μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液于EP管中，加入930μL蒸餾水充分溶解,，配制成0.625μmol/mL的*酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液備用,。

產(chǎn)品說明：

半胱氨酰亞砜裂解酶，簡稱蒜酶,，又名蒜氨酸酶,。半胱氨酰亞砜裂解酶幾乎存在于所有蔥屬植物中，如大蒜,，洋蔥,，韭菜等。蒜氨酸酶存在于液泡內(nèi),，其天然底物蒜氨酸存在于細(xì)胞質(zhì)中,；蒜氨酸酶與蒜氨酸接觸并催化產(chǎn)生蒜素和順、反式阿霍烯并生成*酸和氨等副產(chǎn)物,，也是大蒜等植物辛辣氣味的主要來源,。

半胱酰胺亞砜裂解酶可以催化S-甲基-L-半胱*酸亞砜生成*酸。*酸可與2,4-二硝 * 肼反應(yīng)生成2,4-二硝*腙,，在堿性條件下顯棕紅色,；測定505nm吸光度的變化，即可計算CSL酶活性,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、臺式離心機、可調(diào)式移液器,、微量玻璃比色皿/96孔板,、研缽/勻漿器、蒸餾水和冰,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿，4℃浸提30分鐘,。12000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

2. 液體樣本：直接測定,。(若溶液呈現(xiàn)渾濁,，則離心取上清后再測定)。

二,、測定步驟

1,、 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至505nm,，可見分光光度計用蒸餾水調(diào)零,。

2、操作表：（在1.5mLEP管或者96孔板中加入下列試劑）

混勻,，室溫放置10min,，在505nm波長處測各管吸光度。記作A_測定,，A_對照,，A_{標(biāo)準(zhǔn)}，A_{標(biāo)準(zhǔn)空白},。?A_測定=A_測定-A_對照,，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。（標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)準(zhǔn)空白管只需做1-2次,。）

三,、CSL活性計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：37℃，每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol *酸定義為一個酶活力單位,。

CSL活性（U/mg prot）=（?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}）×V_樣÷（V_樣×Cpr）÷T×F=0.0208×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷Cpr ×F

(2) 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：37℃,，每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol *酸定義為一個酶活力單位。

CSL活性（U/g 質(zhì)量）=（?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}）×V_樣÷（V_樣÷V_樣總×W）÷T×F=0.0208×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F

(3) 按血清（漿）等液體體積計算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol *酸定義為一個酶活力單位,。

CSL活性（U/mL）=（?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}）×V_樣÷V_樣÷T×F=0.0208×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

C_{標(biāo)準(zhǔn)}: *酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的濃度,，0.625μmol/mL；V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積,，0.02mL,；V_樣總：加入的提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，30min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；F：樣本稀釋倍數(shù),。

注意事項：

1. 如果測定結(jié)果?A_測定＞1,，可以對樣本用蒸餾水進(jìn)行稀釋或者縮短第一步反應(yīng)時間；吸光值較小,，可以加大樣本量或者延長第一步反應(yīng)時間至1h或者更長時間,。注意計算時同步修改計算公式。

2. 對于初次測定樣本,，建議將樣本勻漿液用蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋后測定,，選取最佳的稀釋倍數(shù)。洋蔥,、香菇,、大蒜類樣本建議直接稀釋4-10倍后再進(jìn)行最佳稀釋倍數(shù)摸索。（實驗室洋蔥進(jìn)行了8倍稀釋,，蒜進(jìn)行了64倍稀釋）

實驗實例：

1,、 稱取0.1233g蒜樣本，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿,，上清用蒸餾水稀釋64倍,，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.46-0.113=0.347,，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.551-0.064=0.487,，帶入公式計算：

CSL活性（U/g 質(zhì)量）= 0.0208×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F=7.693 U/g 質(zhì)量。

2,、 稱取0.1263g洋蔥樣本,，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，上清稀釋4倍,，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.477-0.382=0.095，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.551-0.056=0.487,，帶入公式計算：

CSL活性（U/g 質(zhì)量）= 0.0208×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F=0.169 U/g 質(zhì)量,。

參考文獻(xiàn)：

[1] Su Qianqian, Tang Jing, Zhao Liyan, et al. Effects of nanocomposite packaging on the quality and formaldehyde content of shiitake mushrooms during storage [J]. Food Science, 2015(8):6.

[2] Kumagai H, ?Hidetoshi KONO, Sakurai H, et al. Comparison of C-S Lyase in Lentinus edodes and Allium sativum [J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2022(66): 2560–2566.

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