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亞鐵離子含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5410

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1. 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg FeSO₄·7H₂O，臨用前加入900μL蒸餾水和20μL濃硫酸,，充分混勻,，配制成40 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液，2-8℃可保存2周,。

產(chǎn)品說明：

鐵是人體必需的微量元素之一,，對于維持機(jī)體正常生理功能具有重要作用。亞鐵離子是血紅蛋白,、肌紅蛋白,、細(xì)胞色素及其他酶系統(tǒng)的重要組成成分，幫助氧的運(yùn)輸,，促進(jìn)脂肪氧化,。缺乏鐵元素容易造成貧血、代謝紊亂,，并影響機(jī)體的免疫功能,。鐵過量是引發(fā)或加劇多種慢性病（如糖尿病,、心腦血管疾病,、神經(jīng)退化性疾病等）的危險因素。

樣本中的Fe²⁺在酸性條件下與三吡啶基三嗪形成藍(lán)色配合物,，在593nm處有吸收峰,，通過測定該波長吸光度即可計算Fe²⁺的含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計,、天平、低溫離心機(jī),、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀,、可調(diào)式移液槍,、渦旋震蕩儀、冰,、蒸餾水,、濃硫酸和氯仿。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,。10000g，4℃離心10min,，取上清置冰上待測,。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率200W,，超聲3秒,，間隔7秒，總時間5min）,；然后10000g,，4℃離心10min，取上清置于冰上待測,。

3. 血清（漿）等液體樣本：直接測定,。若有渾濁請離心后取上清待測。

二,、測定步驟

1. 可見分光光度計預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至593nm，蒸餾水調(diào)零,。

2. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：取10μL 40 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液,，加入990μL蒸餾水，混勻得到400 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液,，將400 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液用試劑一進(jìn)行稀釋得到100,、50、25、12.5,、6.25,、3.125、1.5625μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液備用,，注意標(biāo)準(zhǔn)溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配,。

3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個標(biāo)準(zhǔn)管需800µL標(biāo)準(zhǔn)液。

4. 在1.5mL離心管中按下表步驟加樣：

三,、亞鐵離子含量計算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/L）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)）,，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,，將ΔA測定（y,，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/L）,。

2. 亞鐵離子含量的計算：

（1）按血清（漿）等液體體積計算：亞鐵離子含量（μmol/L）=x

（2）按樣本蛋白濃度計算：亞鐵離子含量（μmol/mg prot）=x×10^-3×V提取÷（Cpr×V提?。?/span>=0.001x÷Cpr

（3）按樣本質(zhì)量計算：亞鐵離子含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×10^-3×V提取÷W=0.001x÷W

（4）按細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計算：亞鐵離子含量(μmol/10⁶ cell)=x×10^-3×V提取÷N= 0.001x÷N

V提取：加入試劑一的體積,，1mL,；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，以10⁶計,；10³：單位換算系數(shù),，1μmol/L=10^-3μmol/mL。

注意事項(xiàng)：

1. 用試劑一稀釋得到的標(biāo)準(zhǔn)液容易失效,，建議現(xiàn)用現(xiàn)配,。

2. 如果?A測定過低或測定管吸光值接近空白管，可以增加樣本量后再進(jìn)行測定,；如果?A測定大于1,，建議將樣本用試劑一適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。注意同步修改計算公式,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例： 

1,、 取0.1026g小鼠肝臟樣本，加入1mL試劑一,，冰浴勻漿,，離心后取上清按照測定步驟操作，使用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.315-0.01=0.305,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0104x-0.008,，R²=0.9948，計算x=30.096,，按樣本質(zhì)量計算：

亞鐵離子含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.001x÷W =0.293 μmol/g 質(zhì)量,。

2、 取800μL牛血清,，按照測定步驟操作,，使用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.400-0.01= 0.390,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0104x-0.008,，R²=0.9948，計算x=38.269,，按液體體積計算：

亞鐵離子含量（μmol/L）=x=38.269 μmol/L,。

參考文獻(xiàn)：

[1] Dong C, Yang M, Wang W. Study on spectrophotometric determination of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) with 2, 4, 6- tri(2′-pyridyl)-1, 3, 5-triazine. [J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2004, (01):76-78.

[2] Huang Y, Ma H, Xu J, et al. Development and Validation of Reference Methods for Determination of Serum iron. [J]. Chinese Journal of Laboratory Diagnosis, 2011, 15(03):453-457.

[3] Wang H, Liu B, Ding Z, et al. Ferene method flow injection analysis as optimized in situ analysis of dissolved iron in marine waters. [J]. Marine Sciences, 2016, 40(05):82-87.

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