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抗氟離子酸性磷酸酶（FRAP）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5455

規(guī)格：100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑三：臨用前加入1mL蒸餾水,，充分溶解,，未用完的試劑-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融,。一支試劑溶解后可以做100T,，為了延長試劑盒使用時間，因此多給一支粉劑,。

2,、 試劑四：臨用前加入5.5mL蒸餾水，充分溶解,，未用完的試劑2-8℃保存可以保存4周,。

3、 試劑五：臨用前根據樣本量按照試劑五：蒸餾水=1:9的比例配制,，現用現配,。

4、 標準品：5μmol/mL 酚標準液,。臨用前取100μL的5μmol/mL 酚標準液于EP管中,，加入300μL蒸餾水充分溶解，配制成1.25 μmol/mL的酚標準液,。

產品說明：

抗氟離子酸性磷酸酶(fluoride resistant acid phosphatase, FRAP)是酸性磷酸酶的一種,。抗氟離子酸性磷酸酶主要分布于在絕大多數細胞的溶酶體中,、前列腺(prostate gland),、腦、肝臟,、脾臟和血小板,。

抗氟離子酸性磷酸酶的活性不被氟離子抑制，而其他的酸性磷酸酶的活性則會受到氟離子的抑制,。酸性條件下,，抗氟離子酸性磷酸酶催化PN PP生成對硝 基苯*。對硝 基苯*在堿性條件下呈黃色,，可以在400nm波長下檢測吸光度,。產物黃色越深，說明抗氟離子酸性磷酸酶活性越高,，反之則酶活性越低,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機,、分析天平,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板,、研缽/勻漿器/超聲破碎儀,、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一,、 樣本處理（可適當調整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W,，超聲3s,，間隔10s，重復30次）,；8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

3,、液體：直接測定。(若溶液呈現渾濁,，則離心取上清后再測定),。

二、測定步驟

1,、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上,，調節(jié)波長至400nm，可見分光光度計用蒸餾水調零,。

2,、操作表：

混勻后，測定在400nm處的吸光度,，記作A_測定,，A_對照,，A_標準，A_標準空白,。?A_測定=A_測定-A_對照,，?A_標準=A_標準-A_標準空白。（標準管和標準空白管只需做1-2次,。）

三,、FRAP活性計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol酚定義為一個酶活力單位。

FRAP活性（U/mg prot）=(?A_測定×C_標準÷?A_標準) ×V_樣÷（Cpr×V_樣）÷T×10³×F=41.67×?A_測定÷?A_標準÷Cpr×F

(2) 按樣本質量計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol酚定義為一個酶活力單位,。

FRAP活性（U/g 質量）= (?A_測定×C_標準÷?A_標準) ×V_樣÷（W÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=41.67×?A_測定÷?A_標準÷W×F

(3) 按細菌或細胞數目計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol酚定義為一個酶活力單位,。

FRAP活性（U/10⁴ cell）= (?A_測定×C_標準÷?A_標準) ×V_樣÷（N÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=41.67×?A_測定÷?A_標準×F

(4) 按血清（漿）等液體體積計算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產生1nmol酚定義為一個酶活力單位。

FRAP活性（U/mL）= (?A_測定×C_標準÷?A_標準) ×V_樣÷V_樣÷T×10³×F=41.67×?A_測定÷?A_標準×F

C_標準：酚標準液,，1.25 μmol/mL ,；V_樣：反應體系中加入的樣本體積，0.01mL,；V_樣總：加入的提取液體積,，1mL；T：反應時間,，30min,；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL,；W：樣本質量,，g；10³：單位換算系數,，1μmol/mL=10³nmol/mL,；N：細胞數量，以萬計,；F：樣本稀釋倍數,。

注意事項：

1、 如果測定的吸光值或?A_測定大于1.5,，可以對樣本進行稀釋或者縮短37℃酶促反應時間,；測定的吸光值或?A_測定小于0.01，可以加大樣本量或者延長37℃酶促反應時間,。最終計算時同步修改計算公式,。

實驗實例：

1、 稱取0.1074g兔子肝臟組織,，加入1mL提取液進行冰浴勻漿,，將上清液稀釋2倍后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.485-0.067=0.418,，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.720-0.070=0.650,，帶入公式計算：

FRAP活性（U/g 質量）=41.67×?A_測定÷?A_標準÷W×F =499.013 U/g 質量

2,、 稱取0.1057g竹子葉，加入1mL提取液進行冰浴勻漿,，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.396-0.110=0.286，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.720-0.070=0.650,，帶入公式計算：

FRAP活性（U/g 質量）= 41.67×?A_測定÷?A_標準÷W×F =173.461U/g 質量

3,、 吸取0.01mL羊血清，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.126-0.070=0.056,，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.720-0.070=0.650，帶入公式計算： 

FRAP活性（U/mL）=41.67×?A_測定÷?A_標準×F =3.590 U/mL 

參考文獻：

[1] Megat R, Wahab A, Dasor M M, et al. Crevicular tartrate resistant acid phosphatase activity and rate of tooth movement under different continuous force applications[J]. African journ al of pharmacy and pharmacology, 2011, 5(20):2213-2219. 

[2] Natasˇa Mitic′, Mohsen Valizadeh, Eleanor W.W. Leung, et al. Human tartrate-resistant acid phosphatase becomes

an effective ATPase upon proteolytic activation [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics 439 (2005) 154–164.

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