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L-乳酸（L-LA）含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動,，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作,。

貨號：BC5345

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑二：臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：450μL（46T）的比例配制試劑二溶液,，現(xiàn)用現(xiàn)配；

2,、 試劑三：臨用前每瓶加入3 mL 蒸餾水混勻,，可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融,；

3,、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.04 mL蒸餾水配成100 μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，2-8℃可保存12周,；

產(chǎn)品說明：

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物,，與糖代謝、脂類代謝,、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān),，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸,，同時使NAD⁺還原生成NADH和H⁺,，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應(yīng),，產(chǎn)生水溶性formazan,，其在450nm處有最大吸收峰，據(jù)此可計算乳酸含量,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

分析天平,、研缽/勻漿器/超聲波細(xì)胞破碎儀、離心機(jī),、可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量玻璃比色皿/96孔板、水

浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、蒸餾水,。 

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g,，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃,，12000g離心10min,，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二,，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生,，4℃ 12000g離心10min后取上清待測,。

2. 細(xì)胞或細(xì)菌：按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞/細(xì)菌加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞/細(xì)菌（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時間3min）,；于4℃,，12000g離心10min，取0.8mL上清液,，再緩慢加入0.15mL提取液二,，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測,。

3. 血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一,，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液,，再緩慢加入0.15mL提取液二,，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測,。

注：提取液二需緩慢加入,，加入后會產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作,。

二,、 測定步驟

1、分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，波長調(diào)至450nm,，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2,、 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將100μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為1.25,、0.625、0.3125,、0.15625,、0.078、0.039,、0.020μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用,。

3、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表：

實(shí)驗(yàn)中每個標(biāo)準(zhǔn)管需10µL標(biāo)準(zhǔn)溶液

3,、加樣表：（按順序?qū)⑾铝性噭┘釉?/span>96孔板/EP管中）

混勻后,，于450nm處測定吸光值,，分別記為A測定管,，A對照管，A標(biāo)準(zhǔn)管,，A空白管,，計算ΔA測定=A測定管-A對照管；ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管,。每個測定管需設(shè)置一個對照管,，空白管和標(biāo)準(zhǔn)曲線只需測定1-2次。

三,、 乳酸含量的計算

1,、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，以其對應(yīng)的吸光值（ΔA標(biāo)準(zhǔn)）為y軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA測定帶入公式中得到x（μmol/mL）,。

2,、乳酸含量計算

（1）按照樣本蛋白濃度計算

LA含量（μmol/mg prot）=x×V樣本÷（V樣本×Cpr）= x÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

LA含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×（V上清+V提取液二）÷ （W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W

（3）按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計算

LA含量（μmol/10⁴ cell）=x×（V上清+V提取液二）÷ （N×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷N

（4）按照液體體積計算

LA含量（μmol/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]=13.0625×x

V樣本：加入的樣本體積，0.01mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時上清液體積,，0.8mL,；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL,；V提取液一：加入的提取

液一體積,，1mL；N：細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量,，10⁴個；V液體：液體樣本體積,，0.1mL,。

注意事項(xiàng)：

1. ΔA測定的測定范圍在0.01-1.1之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值,，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定,，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定,，注意同步計算公式,。

2. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑,，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量,，需另取組織,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1466g小鼠肝加入1mL提取液一,，冰浴勻漿后離心,，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后用蒸餾水稀釋兩倍,，按照測定步驟操作,，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.573-0.091=0.482，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.8941x+0.0016,，R²=0.9991,，計算x=0.5373，按樣本質(zhì)量計算含量得：

LA含量（μmol/g 質(zhì)量）= 1.1875×x÷W×稀釋倍數(shù)=1.1875×0.5373÷0.1466×2=8.7046 μmol/g質(zhì)量,。

2,、 取0.1063g紅薯根加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心,，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,，離心取上清，之后按照測定步驟操作,，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.128-0.105=0.023,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.8941x+0.0016，R²=0.9991,，計算x=0.0239,，按樣本質(zhì)量計算含量得：

LA含量（μmol/g 質(zhì)量）=1.1875×x÷W=1.1875×0.0239÷0.1063=0.2674 μmol/g質(zhì)量。

3,、 取100μL羊血清加入1mL提取液一,，離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,，離心取上清,，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.424-0.104=0.320,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.8941x+0.0016,，R²=0.9991，計算x=0.3561,，按照液體體積計算含量得：

LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=13.0625×0.3561=4.6517 μmol/mL,。

參考文獻(xiàn)：

Eolbergrová J, MacMillan V, Siesj? B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD⁺ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0740/BC0745 己糖激酶（HK）活性檢測試劑盒

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