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ATP含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

微量法

貨號：BC5475

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1,、 提取液：低溫條件下,，可能有結(jié)晶析出，放于60℃水浴加熱溶解即可,，不影響使用,；

2、 試劑二：臨用前加入3.5 mL蒸餾水充分溶解,，可加熱促進溶解,，用不完的試劑2-8℃保存4周；

3,、 試劑四：臨用前取1支加入0.2 mL蒸餾水溶解,，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融,；為延長試劑盒使用時間故多提供一支,；

4、 試劑五：臨用前加入1 mL蒸餾水充分溶解,，用不完的試劑-20℃分裝保存4周,，避免反復(fù)凍融；

5,、 試劑六：臨用前取1支加入0.25 mL蒸餾水備用,，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融,；為延長試劑盒使用時間故多提供一支,；

6、 標(biāo)準(zhǔn)品：5 mg ATP,。臨用前加入0.826 mL蒸餾水配成10 μmol/mL的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液,，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融,；

7,、 0.4μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：臨用前吸取20μL 10 μmol/mL的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液和480μL蒸餾水混合配制成0.4μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)管的測定,；

8,、 工作液的配制：臨用前按試劑二(mL)：試劑三(mL)：試劑四(mL)：試劑五(mL)：試劑六(mL)=0.2mL：0.2mL：0.02mL：0.08mL：0.02mL的比例配制（0.52mL，約10T的量）,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

產(chǎn)品說明：

ATP廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，是生物能量通貨,，能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測定ATP 含量并且計算能荷,，能夠反映能量代謝狀態(tài),。

HK催化葡萄糖和ATP合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPH,，WST-1 可與 NADPH 反應(yīng),，產(chǎn)生水溶性 formazan，在 450nm 下有特征吸收峰,。

技術(shù)指標(biāo)：

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、低溫離心機、可調(diào)式移液槍,、微量玻璃比色皿/ 96孔板,、研缽/勻漿器/超聲波細(xì)胞破碎儀、蒸餾水,、冰和氯仿,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

1,、 血清（漿）中ATP 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿）,，加入1mL 提取液）混合,，充分震蕩，10000g,，4℃離心10min；取上清液至另一EP 管中,，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻,，10000g 4℃離心3min，取上清,，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）,。

2、 組織中ATP 的提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g 組織,，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿,，10000g 4℃離心10min,，取上清至另一EP 管中,，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min,，取上清,，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。

3,、 細(xì)胞或細(xì)菌中ATP 的提?。合仁占?xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清,，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎（冰浴，功率200W,，超聲2s,，停1s，總時間1min）,，10000g 4℃離心10min,；取上清液至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻,，10000g 4℃離心3min,，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）,。

注：以上提取過程嚴(yán)格控制在冰浴條件下進行,。

二、測定步驟

1,、 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min 以上,，調(diào)節(jié)波長到450nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零,。

2,、 試劑一置于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱15min以上。

3,、 （按下表在1.5mLEP管或96孔板中加入相應(yīng)試劑）

充分混勻，吸取200μL反應(yīng)液于微量玻璃比色皿或者96孔板中測定450nm處的吸光值,，記為A測定,、A標(biāo)準(zhǔn)、A空白,，計算ΔA測定=A測定-A空白,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白（空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需做1-2次）。

三、ATP 含量計算

1,、 血清（漿）中ATP 含量計算

ATP含量(μmol/mL) = C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×（V提取+V血清（漿））÷V血清（漿）

=4.4×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

2. 按樣本質(zhì)量計算

ATP含量（μmol/g 質(zhì)量）= C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V提取÷W =0.4×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

3. 按蛋白濃度計算：

ATP含量（μmol/mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣本÷（V樣本×Cpr）=0.4×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

4. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

ATP含量(μmol/10⁴ cell）= C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V提取÷N = 0.4×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,，0.4μmol/mL；V提?。杭尤氲奶崛∫后w積,，1mL；V血清（漿）：血清（漿）體積,，0.1mL,；V樣本：反應(yīng)體系中加入的樣本體積：0.02mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；N：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，以10⁴個。

注意事項：

1,、 加入提取液離心后的上清若為渾濁為正?，F(xiàn)象。

2,、 如果ΔA測定>1.5,，建議將樣本用蒸餾水稀釋后進行測定。注意計算公式中乘以稀釋倍數(shù),；如果吸光值過低或接近空白,，建議統(tǒng)一放置于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h或更長時間后再次測定，也可以加大樣本量后進行測定,，注意同步修改計算公式,。

3、 提取液中含蛋白變性成分,，若按蛋白濃度計算需要另取樣本重新計算,。

實驗實例：

1、 取0.108g兔肌肉組織加入1mL提取液進行冰浴勻漿,，10000g 4℃離心10min,，取上清至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻,，10000g 4℃離心3min，取上清,，置冰上按照測定步驟操作,，使用96孔板測得計算ΔA測定=0.222-0.118=0.104，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.466-0.118=0.348，按樣本質(zhì)量計算含量得：

ATP含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.4×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=1.107μmol/g 質(zhì)量,。

2,、 取0.1g 蒜苗加入1mL提取液進行冰浴勻漿，10000g 4℃離心10min,，取上清至另一EP管中,，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min,，取上清,，置冰上按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=0.284-0.118=0.166,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.466-0.118=0.348,，按樣本質(zhì)量計算含量得：

ATP含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.4×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=1.908μmol/g 質(zhì)量。

參考文獻

[1] Lin X, Wu Y, Chen X, et al. Determination of adenosine phosphate in tobacco leaf by UPLC with phenol-TEA pretreatment [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2014, 20(1): 26-31.

[2] Beutler E, Mathai C K. A comparison of normal red cell ATP levels as measured by the firefly system and the hexokinase system[J]. Blood, 1967, 30(3): 311-320.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0060/BC0065   Na⁺k⁺-ATP酶活性檢測試劑盒

BC0960/BC0965   Ca⁺⁺Mg⁺⁺-ATP酶活性檢測試劑盒

ATP含量檢測試劑盒 微量法 ATP含量檢測試劑盒 微量法