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| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/96S |
| 貨號 | BC5515 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
| 主要用途 | 線粒體乙醛脫氫酶（ALDH2）活性檢測 |
線粒體乙醛脫氫酶（ALDH2）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC5515
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 2-8℃保存 | |
試劑四 | 液體1 mL×1支 | |
試劑五 | 液體2.8 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前取一支試劑二加入1.5mL蒸餾水溶解,，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融,；
2,、 試劑五：沸點(diǎn)低,，在使用時保持低溫以保證正確的吸取量。用后及時封口,。
3,、 工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=110µL：20µL：4µL：6µL：20µL（160µL,，1T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配,。
產(chǎn)品說明：
線粒體乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase 2,，ALDH2）屬于乙醛脫氫酶蛋白家族，存在于很多組織,，特別是肝臟組織內(nèi)含量較高。該酶主要參與乙醇代謝過程的第二步,，在線粒體內(nèi)將乙醛氧化成羧酸，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán),，被分解，解除乙醛對生物體的毒害作用,。另外，ALDH2也可作為酯酶參與硝酸*油的代謝途徑,，是硝酸*油重要的生物活性劑。
ALDH2催化乙醛和NAD+轉(zhuǎn)化為乙酸和NADH,，利用NADH在340nm處吸光值的變化即可計(jì)算得到ALDH2的活性,。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺式離心機(jī)、分析天平,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量石英比色皿/96孔UV板,、可調(diào)式移液槍,、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水,。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,，加入1mL提取液,，在冰上用勻漿器或研缽進(jìn)行快速勻漿（勻漿器可上下研磨30次左右）,。
2. 4℃ 600 g離心10min（如需獲得純度更高的線粒體,，可將此步離心速度改為1000g）,。
3. 將上清液移至另一離心管中，4℃ 11000 g離心15min,，棄上清，留沉淀,。
4. 在沉淀中加入400μL提取液，超聲波破碎（功率200W,，超聲5秒，間隔10秒,，重復(fù)15次），用于ALDH2活性測定,，若用蛋白濃度計(jì)算，取20μL用于蛋白含量測定,。
二,、測定步驟
1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm，紫外分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零,。
2、 工作液37℃預(yù)熱10min,。
3、 操作表：
試劑名稱（µL） | 空白管 | 測定管 |
樣本 | - | 40 |
蒸餾水 | 40 | - |
工作液 | 160 | 160 |
在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入上述試劑,，充分混勻后于340nm處測定1min時的吸光值A1,，迅速置于37℃水浴或培養(yǎng)箱30min（酶標(biāo)儀有控溫功能可將溫度調(diào)至37℃）,，拿出迅速擦干測定31min時的吸光值A2,，計(jì)算ΔA測定=A2測定-A1測定,，ΔA空白=A2空白-A1空白,，ΔA=ΔA測定-ΔA空白?？瞻坠苤恍枳?/span>1-2次。 | ||
三,、ALDH2酶活計(jì)算
A 按微量石英比色皿計(jì)算：
1. 按蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。
ALDH2活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×F=26.795×ΔA÷Cpr×F
2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：每克樣本每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位,。
ALDH2活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T×F =10.718×ΔA÷W×F
3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活定義：每106個細(xì)胞每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位,。
ALDH2活性（U/106 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣÷V樣總×N）÷T×F =10.718×ΔA÷N×F
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L,；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本上清體積，0.04mL,；V樣總：線粒體沉淀中加入提取液體積，0.4mL,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,，需自行測定,；W：樣本質(zhì)量，g,；N：細(xì)胞總數(shù)，以106計(jì),；T：反應(yīng)時間，30min,；109：單位換算系數(shù)，1mol=109nmol,；F：稀釋倍數(shù)。
B 按96孔UV板計(jì)算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可,。
注意事項(xiàng)：
1、 試劑四有毒性,，實(shí)驗(yàn)過程中，請佩戴好防護(hù)用具,。
2、 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL）,，所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量（單獨(dú)測量）,。
3,、 樣本ΔA大于1時,，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。當(dāng)ΔA小于0.01時,，可以延長反應(yīng)時間（60min或更長）來測定。計(jì)算時注意同步更改計(jì)算公式,。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：
1、 取0.1067g小鼠肝臟進(jìn)行樣本處理,，用提取液稀釋4倍后,，按照測定步驟操作,，用96孔UV板測得計(jì)算ΔA測定=A2測定-A1測定=0.743-0.169=0.574，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.102-0.102=0,，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.574-0=0.574，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：
ALDH2活性（U/g質(zhì)量）=0.574÷（6.22×103×0.6）×109×2×10-4÷（0.04×0.1067÷0.4）÷30×4=384.388 U/g質(zhì)量,。
2、 取0.1069g冬棗果肉進(jìn)行樣本處理,，按照測定步驟操作,，用96孔UV板測得計(jì)算ΔA測定=A2測定-A1測定=0.177-0.119=0.058,，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.102-0.102=0,，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.058-0=0.058，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：
ALDH2活性（U/g質(zhì)量）=0.058÷（6.22×103×0.6）×109×2×10-4÷（0.04×0.1069÷0.4）÷30=9.692 U/g質(zhì)量,。
3,、 取8×106個細(xì)胞進(jìn)行樣本處理，按照測定步驟操作,，用96孔UV板測得計(jì)算ΔA測定=A2測定-A1測定=0.160-0.109=0.051，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.102-0.102=0,，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.051-0=0.051，按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活得：
ALDH2活性（U/106 cell）=0.051÷（6.22×103×0.6）×109×2×10-4÷（0.04×8÷0.4）÷30=0.114 U/106 cell,。
參考文獻(xiàn)：
[1] Feng Liu, Xiangqin Cui, Harry Horner, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity is required for male fertility in maize. The Plant Cell. May 2001, 13:1063-1078
[2] Ying Hu, Jinbin Yin, Mingzhi Zheng, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity protects against lipopolysaccharideinduced cardiac dysfunction in rats. Molecular Medicine Reports. February 2015, 11:1509-1515
[3] Amit Joshi, Lauren Wassenhove, Kelsey Logas, et al. Aldehyde dehydrogenase 2 activity and aldehydic load contribute to neuroinflammation and Alzheimer’s disease related pathology. Acta Neuropathologica Communications. December 2019, 7:190
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