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精*酸酶活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5555

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1,、 提取液二和試劑五為易揮發(fā)試劑,，用完及時擰蓋封口。

2,、 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990µL：10µL（1T）的比例配制,，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用,，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一中。

3,、 試劑一：臨用前加入3.2mL試劑二,，充分溶解，請勿放置于-20℃保存,。2-8℃可保存4周

4,、 標(biāo)準(zhǔn)品：1mol/L（即1000μmol/mL）尿素標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

*酸酶（Arginase）又稱L*酸尿素水解酶或*氨酸脒基水解酶,，是一種錳金屬酶,。精*酸酶存在于細菌、酵母,、植物,、無脊椎動物和脊椎動物中，并被認為最早出現(xiàn)在細菌中,。微生物體內(nèi)的*酸酶其主要功能可能是參與維持L-精*酸的動態(tài)平衡,，并參與調(diào)控多種重要代謝過程。

*酸酶將L-精*（L-arginine）分解為L-鳥*酸（L-ornithine）和尿素（urea）,，尿素與α-異亞硝基*丙酮反應(yīng)生成560nm處存在吸收峰的衍生物,，通過測定尿素的生成量，可計算得到*酸酶活性大小,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、分析天平,、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板,、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀,、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

1、 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心20min,，取上清,，置冰上待測。

2,、 細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率200W,，超聲3s，間隔10s,，重復(fù)30次）,；12000g 4℃離心20min，取上清,，置冰上待測,。。

二,、測定步驟

1,、 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至560nm,，可見分光光度計用蒸餾水調(diào)零,。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：將標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水分別稀釋為50,、25,、12.5、6.25,、3.125 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表

實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需48µL標(biāo)準(zhǔn)溶液,。

4,、在1.5mLEP管中按下表步驟加樣：

三、精*酸酶活性計算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x,，μmol/mL）和吸光度ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}（y,，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,，將ΔA_測定代入方程得到x（μmol/mL）。

2. 精*酸酶活計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：37℃每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol尿素定義為一個酶活力單位,。

精*酸酶活性（U/mg prot）=x×V_樣÷（Cpr×V_樣）÷T×F= x÷30÷Cpr×F

(2) 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：37℃每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol尿素定義為一個酶活力單位,。

精*酸酶活性（U/g 質(zhì)量）= x×V_樣÷（W÷V_樣總×V_樣）÷T×F= x÷30÷W×F

(3) 按細菌或細胞數(shù)目計算

單位的定義：37℃每10⁶個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol尿素定義為一個酶活力單位。

精*酶活性（U/10⁶ cell）= x×V_樣÷（N÷V_樣總×V_樣）÷T×F= x÷30÷N×F

V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積,，0.048mL,；V_樣總：加入的提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，30min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；N：細胞或細菌數(shù)目,，以10⁶計； F：樣本稀釋倍數(shù),。

注意事項：

1,、 如果測定吸光值大于1.5或?_測定大于0.7，可以對樣本進行稀釋或者縮短第一步37℃反應(yīng)時間,；測定吸光值或?_測定過小,，可以加大樣本量或者延長第一步37℃反應(yīng)時間。最終計算時同步修改計算公式,。

實驗實例：

1,、 稱取0.1198g小鼠腎臟組織，加入提取液進行冰浴勻漿,，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算?_測定=A_測定-A_對照=0.425-0.102=0.323，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0168x-0.0541（R² = 0.9941）,，x=22.446 μmol/mL,，帶入公式計算：

精*酸酶活性（U/g 質(zhì)量）= x÷30÷W×F =6.245 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.0989g胡蘿卜，加入提取液進行冰浴勻漿,，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算?_測定=A_測定-A_對照=0.086-0.063=0.023，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0168x-0.0541（R² = 0.9941）,，x=4.5893 μmol/mL,，帶入公式計算：

*酸酶活性（U/g 質(zhì)量）= x÷30÷W×F=1.547 U/g 質(zhì)量

參考文獻：

[1] Chen H, Mccaig B C, Melotto M, et al. Regulation of Plant Arginase by Wounding, Jasmonate, and the Phytotoxin Coronatine[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(44):45998-46007.

[2] Ishii N, Ikenaga H, Carmines P K, et al. High glucose augments arginase activity and nitric oxide production in the renal cortex[J]. Metabolism, 2004, 53(7):868-874.

[3] Zharikov S, Krotova K, Hu H, et al. Uric acid decreases NO production and increases arginase activity in cultured pulmonary artery endothelial cells[J]. American Physiological Society, 2008(5). 

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