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蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

微量法

貨號(hào)：BC5795

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1,、 提取液配制：臨用前根據(jù)樣本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL進(jìn)行配制,，勿一次性全部混合。

2、 若試劑二有析出,，可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用,。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg還原型谷*甘肽（GSH）,。臨用前加入1.3mL蒸餾水配制成25μmol/mL,，2-8℃保存4周。

4,、 0.125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制：取50μL 25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品,，加入950μL蒸餾水，充分混勻,，配制成1.25μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品,；然后取100μL 1.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入900μL蒸餾水,，充分混勻,，配制成0.125μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品使用，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

產(chǎn)品說(shuō)明：

蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子,，存在于一切生物體內(nèi),，是生命的基礎(chǔ)物質(zhì),。二硫鍵是連接不同肽鏈或同一肽鏈中，兩個(gè)不同半胱氨*殘基的巰基的化學(xué)鍵,。二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響很大,，在蛋白質(zhì)分子中，起著穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用,，所以測(cè)定蛋白質(zhì)二硫鍵含量尤為重要,。

還原劑會(huì)使二硫鍵裂解，裂解后的巰基會(huì)發(fā)生親核反應(yīng),，即巰基與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng),，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰,，據(jù)此可以計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè),。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量玻璃比色皿/96孔板、天平,、低溫離心機(jī),、研缽/勻漿器、丙酮（AR）,、蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g,，加入1mL提取液）加入提取液,，冰浴勻漿后于4℃，3000rpm 離心10min,，棄上清,。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀,，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。（注：（1）植物葉片等纖維含量較高的樣本，溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min,，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),,；（2）加入試劑一后會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生，請(qǐng)緩慢加入,，建議使用5mL的EP管）,。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W,，超聲3秒,，間隔10秒，總時(shí)間3min）后,，于4℃,，3000rpm 離心10min，棄上清,。在沉淀中加入2mL試劑一,，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。（注：（1）若沉淀溶解不全,，可4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),；（2）加入試劑一后會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生,，請(qǐng)緩慢加入，建議使用5mL的EP管）,。

3. 血清/血漿,、牛奶等液體：取100μL液體樣本加入0.9mL丙酮,，4℃,，3000rpm 離心10min,，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀,，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。（注：若測(cè)定數(shù)值偏小，可改變樣本與丙酮的比例,，如取0.2mL液體樣本加入0.8mL丙酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙酮,，注意同步修改計(jì)算公式）。

二,、測(cè)定步驟

1,、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm,，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零,。

2、 操作表：（建議在2mL的EP管中操作）

三,、蛋白質(zhì)二硫鍵含量的計(jì)算

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/mg prot）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（V樣本×Cpr）÷2×F

=0.0625× ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×Cpr×F

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷W÷2×F

=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

3. 按照液體體積計(jì)算：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/mL）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷V液樣÷2×F

=1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

4. 按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol /10⁶ cell）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷N÷2×F
=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度,，0.125μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.3mL,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL，蛋白濃度需自行測(cè)定,，可以使用BCA方法測(cè)定,；W：樣本質(zhì)量，g,；V試劑一：提取時(shí)加入試劑一體積,，2mL；V液樣：提取時(shí)加入的樣本體積,，0.1mL,；2：一個(gè)二硫鍵裂解產(chǎn)生兩個(gè)巰基；F：稀釋倍數(shù),；N：細(xì)胞/細(xì)菌總數(shù),，以10⁶計(jì)。

注意事項(xiàng)：

1. 若樣本Δ測(cè)定A<0.01,，可適當(dāng)增大樣本量后測(cè)定,，注意同步修改空白管和標(biāo)準(zhǔn)管及計(jì)算公式；若樣本ΔA測(cè)定>1.5,，可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測(cè)定,，注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1,、 取100μL馬血清,，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.348-0.113）-（0.047-0.045）=0.233,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312,，按樣本液體體積計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/mL）= 1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F =0.933μmol/mL。

2,、 取0.1036g鼠肝,，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.475-0.107）-（0.261-0.105）=0.212,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312,，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.820μmol/g 質(zhì)量。

3,、 取0.1078g黃豆粉,，沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后，按照測(cè)定步驟操作,，用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.762-0.084）-（0.123-0.070）=0.625,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312,，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =4.646μmol/g 質(zhì)量。

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