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尿酸酶活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作,。

貨號：BC4430

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制： 

1,、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入898 µL蒸餾水得到1 mmol/mL的過氧*氫溶液,，2-8℃保存4周,。

2、 工作液A的配制：按照試劑二：試劑三：試劑四 = 0.85mL：2.55mL：1.7mL（共5.1mL,，6S）的比例配制,，用于樣本測定管、空白管及標(biāo)準(zhǔn)管的檢測,。根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用,，配后建議2小時內(nèi)用完（2-8℃或者冰上保存）。

3,、 工作液B的配制：按照試劑二：試劑三：試劑一 = 0.85mL：2.55mL：1.7mL（共5.1mL,，6S）的比例配制，用于樣本對照管的檢測,。根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用,，配后建議2小時內(nèi)用完（2-8℃或者冰上保存）。

產(chǎn)品說明：

尿酸酶,，又名尿酸*化酶,，是一種參與嘌呤降解途徑的氧化酶，可以將尿酸分解為尿囊酸素進(jìn)而排出體外,。尿酸為嘌呤代謝的終末產(chǎn)物,，積累過多將導(dǎo)致痛風(fēng)、腎病,、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生。尿酸酶在尿酸相關(guān)疾病的臨床檢測以及治療中有著重要意義,。

尿酸酶催化尿酸分解為尿*素,、CO₂和H₂O₂，H₂O₂氧化亞鐵*中的Fe²⁺生成Fe³⁺,，Fe³⁺進(jìn)一步與4-氨基安*比林和酚反應(yīng)生成紅色醌類化合物,，在505 nm處有特征吸收峰，通過測定505 nm處的吸光值來反映尿酸酶的活性,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計,、低溫離心機,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1 mL玻璃比色皿,、可調(diào)式移液槍,、研缽/勻漿器/細(xì)胞超

聲破碎儀、冰,、EP管,、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照組織質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）為1 : 5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織,，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000 rpm,，4℃,，離心10 min，取上清置于冰上待測,。

細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）: 提取液體積（mL）為500~1000 : 1的比例（建議500萬個細(xì)菌或細(xì)胞加入1 mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200 W,，超聲3 s，間隔7 s,，總時間5 min）,；然后10000 rpm，4℃,，離心10 min,，取上清置于冰上待測。

二,、測定步驟

1,、 分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至505 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、 將1 mmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.25 µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用,。標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：取20μL 1mmol/mL過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液,，加入1980μL蒸餾水，充分混勻,，配制成10μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液,，再取50μL 10μmol/mL過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液，加入1950μL蒸餾水,，充分混勻,，配制成0.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配,。（實驗中每管需要150μL,，為減小實驗誤差，故配制大體積）,。

3,、 操作表：(在1.5 mL離心管中)

三,、尿酸酶活性計算

（1）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：在pH 8.8的條件下,，每克樣本每小時分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H₂O₂定義為一個酶活力單位。

尿酸酶酶活（U/g 質(zhì)量）= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（W×V樣本÷V提取）÷T

= 0.5×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

（2）按蛋白濃度計算

酶活定義：在pH 8.8的條件下,，每毫克蛋白每小時分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H₂O₂定義為一個酶活力單位,。

尿酸酶酶活（U/mg prot）= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（Cpr×V樣本）÷T

= 0.5×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：在pH8.8的條件下，每10⁴個細(xì)菌或細(xì)胞每小時分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H₂O₂定義為一個酶活力單位,。

尿酸酶酶活（U/10⁴ cell）= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（N×V樣本÷V提?。?/span>÷T

=0.5×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.25 µmol/mL,；V樣本：加入的樣本體積,，0.15 mL；V提?。禾崛∫后w積,，1 mL；T：酶促反應(yīng)時間：0.5 h,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；N：細(xì)菌數(shù)量（以萬計）,。

注意事項：

1,、 A大于1時，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定,，并在計算時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。

2、 工作液A與工作液B,，需根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用,，配后建議2小時內(nèi)用完,。工作液本身為淡黃色，隨著時間的延長,，會變?yōu)榧t色,，如有變色，則視為失效,，需重新配制,。

實驗實例：

1、 取0.1g小鼠肝臟進(jìn)行樣本處理,，取上清稀釋8倍后按測定步驟操作,，測定計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.652-0.218=0.434，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.614-0.017=0.597,，按樣本質(zhì)量計算酶活得：尿酸酶酶活（U/g 質(zhì)量）= 0.5×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×8（稀釋倍數(shù)）=29.08 U/g 質(zhì)量,。

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