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果膠裂解酶（PL）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作,。

貨號(hào): BC2645

規(guī)格: 100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1. 工作液：將試劑一倒入試劑二于50℃水浴中溶解（期間可拿出振蕩數(shù)次）,。該試劑易長菌，配制完成后可-20℃分裝保存,，可保存12周,。

產(chǎn)品說明：

果膠裂解酶（EC4.2.2.10）是果膠酶的重要組成部分，催化果膠分子鏈的消除裂解,。來源比較廣泛,，主要來源于微生物，在食品加工工業(yè)中提高果汁產(chǎn)量方面有重要意義,，在減少環(huán)境污染和降低能源消耗方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,。

果膠裂解酶作用于果膠中的α-1,4糖苷鍵，生成在還原端C4和C5之間位置具有不飽和鍵的不飽和寡聚半乳糖醛酸，在235nm處有特征吸收峰,，測定235nm下吸光度的上升來表示果膠裂解酶的活性,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋,、微量石英比色皿/96孔UV板,、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。10000g ,，4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

2. 細(xì)胞、細(xì)菌或真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時(shí)間3min）,；然后10000g,，4℃離心10min,，取上清置于冰上待測。（細(xì)菌,、真菌等難以數(shù)量計(jì)算的微生物也可以稱取0.1g 細(xì)菌/真菌沉淀來進(jìn)行前處理）

3. 培養(yǎng)液：直接測定,。

二、測定步驟

1,、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至235nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 操作表：

三,、果膠裂解酶活性計(jì)算

A,、按微量石英比色皿計(jì)算：

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下,，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

PL活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T=64.1×ΔA÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下,，每克組織每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

PL活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 64.1×ΔA÷W

1. 按照細(xì)菌、真菌貨細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下,，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PL活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×N÷V樣總）÷T= 64.1×ΔA÷N

3. 按照培養(yǎng)液體積計(jì)算

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下,，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PL活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T= 64.1×ΔA

ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數(shù),，5200 L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V反總：反應(yīng)總體積,，0.0002 L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積,，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；T：反應(yīng)時(shí)間，30min,；10⁹：換算系數(shù),，1mol=10⁹nmol,；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬計(jì),。

B,、按96孔UV板計(jì)算：

將上述公式中的d-1cm修改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1,、 若A1測定管大于1.5或者ΔA大于0.5,，將樣本粗酶液用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測定。

2,、 建議一次測定不要測定過多樣本以免耽誤過多的酶促反應(yīng)時(shí)間,。

3、 空白管正常情況下變化不超過0.02,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1,、 取0.1g香蕉皮加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ,，4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。之后按照測

定步驟操作,，用微量石英比色皿測得計(jì)算ΔA測定管= A2測定管-A1測定管=0.528-0.5254=0.0026，ΔA=

ΔA測定管-ΔA空白管=0.1551-0.1542=0.0009,，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

PL活性（U/g 質(zhì)量）= 64.1×ΔA÷W=1.090 U/g 質(zhì)量,。

2、 取0.1g大腸桿菌沉淀加入1mL提取液冰浴超聲波破碎細(xì)胞,，然后10000g,，4℃離心10min，取上清置于冰上,，之后按照測定步驟操作,，用微量石英比色皿測得計(jì)算ΔA測定管= A2測定管-A1測定管=1.2213-0.8277=0.3936，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.1551-0.1542=0.0009,，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

3,、 PL活性（U/g 質(zhì)量）= 64.1×ΔA÷W=251.721 U/g 質(zhì)量。

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC2630/BC2635 果膠酶活性檢測試劑盒

BC3680/BC3685 原果膠含量檢測試劑盒

BC4150/BC4155 離子結(jié)合型果膠（ISP）含量檢測試劑盒

BC2660/BC2665 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性檢測試劑盒

果膠裂解酶活性檢測試劑盒 微量法 果膠裂解酶活性檢測試劑盒 微量法