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果糖-1, 6-二磷酸醛縮酶（FBA）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC2275

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1,、 試劑二：臨用前加入2 mL蒸餾水,，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

2、 試劑三：臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解,，用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

3、 試劑四：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中,。臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解,，用不完的試劑-分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融,；

4,、 試劑五：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解,，用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：

果糖1,6-二磷酸醛縮酶（Fructose 1,6 bisphosphate aldolase,，FBA）（EC4.1.2.13）是糖酵解、糖異生,、磷酸戊糖途徑及光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶,，催化果糖1,6-二磷酸可逆的裂解為磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛，廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi),，在各種逆境脅迫下表現(xiàn)不同的響應(yīng),。

果糖1,6-二磷酸醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在磷酸丙糖異構(gòu)酶和α-磷酸甘油脫氫酶作用下催化NADH和磷酸二羥丙酮生成NAD和α-磷酸甘油,，340nm處吸光值的變化可反映果糖1,6-二磷酸醛縮酶活性的高低,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、天平、低溫離心機(jī),、微量石英比色皿/96孔UV板,、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器,、漩渦震蕩儀,、超聲破碎儀、冰,。

操作步驟：

一,、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

①總FBA酶：

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液一）充分冰浴勻漿,，然后8000g，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

細(xì)菌或細(xì)胞：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時間3min）,；然后8000g,，4℃，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

液體：直接檢測。

②胞漿和葉綠體FBA酶的分離：

（1） 按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5-10的比例（建議稱取約0.1g樣本,，加入1mL提取液一）,，手工快速研磨或勻漿，之后于4℃,，200g離心5min,；

（2） 棄沉淀，取上清在4℃,，8000g離心10min（離心時緩慢加速和降速）,；

（3） 取上清用于測定胞漿FBA酶活性，取沉淀加1mL提取液二,，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴,，200W，破碎3s,，間歇7s,，總時間1min），然后4℃,，8000g離心10min,，上清即為葉綠體中FBA酶活性。

建議測定總FBA酶活性,，按照步驟①提取粗酶液,，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的FBA，則按照步驟②提取粗酶液,。

二,、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 樣本測定：(在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑)

注意：如果檢測樣本量大,，可以將試劑一,、二、三,、四,、五按照5:1:1:1:1（V:V:V:V:V）的比例配成工作液待用（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

三,、FBA酶活計算

A,、 按微量石英比色皿計算：

1、按蛋白濃度計算

酶活單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

FBA酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每g組織每分消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

FBA酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

3,、按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計算

酶活單位定義：每10⁴個細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

FBA酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）4,、按液體體積計算

酶活單位定義：每mL液體每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

FBA酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；T：反應(yīng)時間,，5min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,，蛋白濃度自行測定,；W：樣本質(zhì)量，g,；10⁹：單位換算系數(shù),，1mol=10⁹nmol,。

B、按96孔UV板計算：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計算即可,。

注意事項：

1,、若ΔA大于0.8建議將樣本用相應(yīng)提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧龠M(jìn)行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù),。

2,、若是植物樣本，建議在提取完成后2h內(nèi)檢測完,，如果樣本量過大,，建議分批提取、檢測,。

3,、由于提取液一中含有一定濃度的蛋白（約0.5mg/mL），所以在測定樣品蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1,、 取0.1g小鼠肝臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清稀釋8倍后按照測定步驟操作,，使用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.3061-1.125=0.1811,，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.1983-1.1858=0.0125，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.1811-0.0125=0.1686,，按樣本質(zhì)量計算酶活：

FBA酶活（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W×8（稀釋倍數(shù)）= 321.54×0.1686÷0.1×8（稀釋倍數(shù)）=4337 U/g 質(zhì)量,。

2、 取0.1g綠蘿加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨,，取上清后按照測定步驟操作,，使用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.4458-1.37=0.0758，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.1983-1.1858=0.0125,，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.0758-0.0125=0.0633,，按樣本質(zhì)量計算酶活：

FBA酶活（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W=321.54×0.0633÷0.1=204 U/g 質(zhì)量。

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC2240/BC2245  果糖-1,6-二磷酸（FDP）含量檢測試劑盒

BC0530/BC0535  磷酸果糖激酶（PFK）活性檢測試劑盒