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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動,，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC2195

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑四：臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解待用；可分裝后-20℃保存4周,，避免反復(fù)凍融,；

2、 試劑五：臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解待用,；可分裝后-20℃保存4周,，避免反復(fù)凍融；

3,、 試劑六：臨用前加入250μL 試劑六溶解液溶解,；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融,；

4,、 試劑七：臨用前加入5.26 mL蒸餾水，可分裝后-20℃保存4周,，避免反復(fù)凍融,；

5、 工作液的配制：根據(jù)樣本數(shù)量按體積比試劑二：試劑三：試劑四：試劑五：試劑六：試劑六溶解液：試劑七=270μL：270μL：270μL：270μL：35μL：325μL：360μL（共1.8mL,，20T）的比例混合,。工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（EC 4.1.1.31）廣泛存在于植物和微生物中,，在動物及絲狀霉菌中缺乏此酶,。是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸呈不可逆反應(yīng)的酶，同時也是C4植物和CAM植物固定CO₂的關(guān)鍵酶,，對三羧酸循環(huán)的運轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用,。

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂生成草酰乙酸和HPO₄^2-，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在340nm測定NADH減少速率,，計算PEPC活性,。

Phosphoenolpyruvate + CO₂                                   Oxalylacetic Acid + HPO₄^2-

Oxalylacetic Acid + NADH                        Malic acid + NAD⁺

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者

增加樣本量進行檢測,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀,、臺式離心機、水浴鍋,、微量石英比色皿/96孔UV板,、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

1,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿,，然后，8000g,，4℃,，離心20min。

2,、細菌或細胞：按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒,，間隔7秒,，總時間3min）；然后8000g,，4℃,，離心20min，取上清置于冰上待測,。

3,、血清（漿）等液體：直接檢測。若有渾濁則離心后取上清測定,。

二,、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2,、 根據(jù)樣本量取部分試劑一和工作液置于30℃平衡10min,。

3,、 操作表（在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑）：

在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入上述試劑，充分混勻后于340nm處測定10s時的吸光值A1,，迅速置于30℃水浴或培養(yǎng)箱5min（酶標儀有控溫功能的可將溫度調(diào)至30℃）,，拿出迅速擦干測定310s時的吸光值A2，計算ΔA測定管=A1測定-A2測定,，ΔA空白管=A1空白-A2空白,，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次）

三,、PEPC酶活計算

1,、 按微量石英比色皿計算：

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=321×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

PEPC酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T =321×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

PEPC酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×N）÷T=321×ΔA÷N

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/ mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4L,；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；V樣總：加入提取液體

積，1mL,；T：反應(yīng)時間：5min,；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol,；N：細胞數(shù)量,，以萬計。

2,、 按96孔UV板計算：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可,。

注意事項：

1、 為保證實驗結(jié)果的準確性,，需先取1-2個樣做預(yù)實驗,，ΔA大于0.6時，建議將粗酶液用提取液稀釋后再進行測定。當ΔA小于0.01時,，可以延長反應(yīng)時間（10min或15min）來測定,。

2、 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔,，正常情況下,，變化不超過0.02。

實驗實例：

1,、 取0.1g天竺葵葉片加入1mL提取液進行勻漿研磨,，取上清之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A1測定-A2測定=1.013-0.9753=0.0377,，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.8407-0.8392=0.0015,，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.0377-0.0015=0.0362，按樣本質(zhì)量計算酶活：

PEPC酶活（U/g質(zhì)量）=321×ΔA÷W=321×0.0362÷0.1=116.202 U/g 質(zhì)量,。

2,、 取0.1g蘆薈葉片加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清之后按照測定步驟操作,，測得計算ΔA測定=A1測定-A2測定=0.7049-0.6699=0.035,，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.8407-0.8392=0.0015，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.035-0.0015=0.0335,，按樣本質(zhì)量計算酶活：

PEPC酶活（U/g質(zhì)量）=321×ΔA÷W=321×0.0355÷0.1=107.535 U/g 質(zhì)量,。

參考文獻：

[1] Zhang Y H, Wang Z M, Huang Q, et al. Phosphoenolpyruvate carboxylase activity in ear organs is related to protein concentration in grains of winter wheat[J]. Journal of cereal science, 2008, 47(2): 386-391.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0740/BC0745  己糖激酶（HK）活性檢測試劑盒

BC0540/BC0545  丙酮酸激酶（PK）活性檢測試劑盒

BC0530/BC0535  磷酸果糖激酶（PFK）活性檢測試劑盒

 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性檢測試劑盒微量 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性檢測試劑盒微量