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糖原合成酶（GCS）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動,，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC3330

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1、 試劑四：提供一個5 mL試劑瓶,，用前取1支加入3mL試劑一充分溶解,，-20℃分裝保存4周，避免反復凍融,；

2,、 試劑五：提供一個5 mL試劑瓶，用前取1支加入3mL試劑一充分溶解,，-20℃分裝保存4周,，避免反復凍融；

3,、 工作液的配制：臨用前將試劑三離心,，取20 μL試劑三，加14 mL試劑一,、3 mL試劑四、3mL試劑五,，充分混合（約26T）,，現(xiàn)用現(xiàn)配，也可根據(jù)樣本量按比例配制,；

4,、 試劑八的配制：

（1） 臨用前取1瓶試劑八中加入6mL試劑二充分溶解，再將1支試劑七轉(zhuǎn)移到試劑八中混合溶解后待用,，可-20℃分裝保存4周,，避免反復凍融；

（2） 用前先將試劑六離心,，取55 μL試劑六加入5.74 mL上述（1）中溶液,，充分混合（約28T），現(xiàn)用現(xiàn)配,，也可根據(jù)樣本量按比例配制,。

產(chǎn)品說明：

糖原合成酶（Glycogen synthase , GCS）將UDPG的糖基加到原有糖原或是糖原蛋白的非還原端，以α-1,4糖苷鍵連接。GCS是動物機體糖原合成過程的限速酶,，同時也是胰島素作用的主要靶酶,，在糖代謝及維持血糖相對穩(wěn)定的過程中有著重要作用。

GCS催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UDP,，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH生成NAD⁺,，在340 nm下測定NADH的下降速率，即可反映GCS活性,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計,、低溫臺式離心機,、水浴鍋、1mL石英比色皿,、可調(diào)式移液槍,、超聲破碎儀、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后,，8000g,，4℃離心10min，取上清置于冰上待測,。

細菌或細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細胞數(shù)量（10⁴個）:提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細菌或細胞（功率200w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后8000g，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測。

血清等液體：直接檢測,。（若溶液渾濁則離心后取上清進行測定）

二,、測定步驟

1,、 紫外分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、 臨用前將工作液與試劑八置于37℃水浴鍋中預熱5min（工作液用多少預熱多少）,。

3,、 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑：

三,、GCS酶活計算

1. 按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GCS酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣本每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

GCS酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T =3215.4×ΔA÷W

3. 按細菌或細胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

GCS酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量（萬個））÷T

= 3215.4×ΔA÷細胞數(shù)量（萬個）

4. 按液體體積計算

酶活定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GCS酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T =3215.4×ΔA

ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,；10⁹：單位換算系數(shù),，1mol=10⁹nmol；

V反總：反應體系總體積,，1×10^-3L,；V樣：反應體系中樣本體積，0.05mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；T：反應時間：1min。

注意事項：

1,、 樣本提取上清液置于冰上待測,，提取樣本建議當天測完。

2,、 若ΔA大于0.2,，建議將樣本用提取液稀釋適當倍數(shù)后測定,，以提高檢測靈敏度，并在計算公式中乘以相應的稀釋倍數(shù),。

實驗實例：

1,、 取0.1g小鼠心臟加入1mL提取液進行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作,，測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.177-1.119=0.058,，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.944-0.939=0.005，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.058-0.005=0.053,，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：

GCS酶活（U/g 質(zhì)量）=3215.4×ΔA÷W=1704.162 U/g 質(zhì)量,。

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0360/BC0365  β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性檢測試劑盒

BC2600/BC2605  酸性木聚糖酶（ACX）活性檢測試劑盒

BC4290/BC4295  N-乙酰基-β-葡萄糖苷酶（NAG）活性檢測試劑盒