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蛋白質(zhì)游離巰基含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5890

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1,、 提取液配制：臨用前根據(jù)樣本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL進(jìn)行配制,，請勿一次性全部混合。

2,、 若試劑二有析出,，可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用。

3,、 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg還原型谷*甘肽（GSH）,。臨用前加入1.3mL蒸餾水配制成25μmol/mL，2-8℃保存4周,。

4,、 0.125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制：取50μL 25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入950μL蒸餾水,，充分混勻,，配制成1.25μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品；然后取100μL 1.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品,，加入900μL蒸餾水,，充分混勻，配制成0.125μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品備用,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

產(chǎn)品說明：

巰基的存在使得蛋白質(zhì)能夠進(jìn)行二硫鍵的形成，從而維持分子的穩(wěn)定性和功能性,。此外,，巰基還參與到氧化還原反應(yīng)中，具有重要的生物學(xué)作用,。在細(xì)胞內(nèi),，巰基含量的變化與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān),，因此巰基也成為了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要研究對象。本試劑盒測定的是蛋白質(zhì)中的游離巰基含量,。

一定條件下巰基會發(fā)生親核反應(yīng),，即巰基與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物,，在412nm處有最大吸收峰,，據(jù)此可以計(jì)算蛋白質(zhì)游離巰基含量。

-SH +DTNB            TNB（412nm）

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿,、低溫離心機(jī),、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、丙酮（AR）,、蒸餾水,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液,，冰浴勻漿后于4℃,，3000rpm 離心10min，棄上清,。在沉淀中加入2mL試劑一,，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。（注：（1）植物葉片等纖維含量較高的樣本,，溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),,；（2）加入試劑一后會有大量氣泡產(chǎn)生,，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）,。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁶個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒,，間隔10秒,，總時間3min）后，于4℃,，3000rpm 離心10min,，棄上清,。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀,，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。（注：（1）若沉淀溶解不全，可4℃ 3000rpm離心3min,，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),；（2）加入試劑一后會有大量氣泡產(chǎn)生，請緩慢加入,，建議使用5mL的EP管）,。

3. 血清/血漿、牛奶等液體：取100μL液體樣本加入0.9mL丙酮,，4℃,，3000rpm 離心10min，棄上清,。在沉淀中加入2mL試劑一,，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。（注：若測定數(shù)值偏小,，可改變樣本與丙酮的比例，如取0.2mL液體樣本加入0.8mL丙酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙酮,，注意同步修改計(jì)算公式）,。

二、測定步驟

1,、 可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 操作表：（建議在5mL的EP管中操作）

三,、蛋白質(zhì)游離巰基含量的計(jì)算

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/mg prot）=ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（V樣本×Cpr）×F

=0.125× ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×Cpr×F

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷W×F

=0.25×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

3. 按照液體體積計(jì)算

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/mL）=ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷V液樣×F

=2.5×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

4. 按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/10⁶ cell）= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷N×F

= 0.25×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度,，0.125μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積,，0.5mL,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,，蛋白濃度需自行測定,；W：樣本質(zhì)量，g,；V試劑一：提取時加入試劑一體積,，2mL；V液樣：提取時加入的樣本體積,，0.1mL,；F：稀釋倍數(shù)。N：細(xì)胞/細(xì)菌總數(shù),，以10⁶計(jì),。

注意事項(xiàng)：

1. 若樣本ΔA測定<0.01，可適當(dāng)增大樣本量后測定,，注意同步修改空白管和標(biāo)準(zhǔn)管及計(jì)算公式,；若樣本ΔA測定>1.5，可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測定,，注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

2. 可使用BCA法測定蛋白濃度,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1,、 取100μL馬血清，按照測定步驟操作,，用1mL玻璃比色皿測得ΔA測定=A測定-A對照=0.110-0.021=0.089,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本液體體積計(jì)算蛋白質(zhì)游離巰基含量得：

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/mL）=2.5×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F =0.399μmol/mL,。

2,、 取0.1036g鼠肝，按照測定步驟操作,，用1mL玻璃比色皿測得ΔA測定=A測定-A對照=0.339-0.095=0.244,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)游離巰基含量得：

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.25×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =1.057μmol/g 質(zhì)量,。

3,、 取0.1078g黃豆粉,，沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后，按照測定步驟操作,，用1mL玻璃比色皿測得ΔA測定=A測定-A對照=0.108-0.033=0.075,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)游離巰基含量得：

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.25×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.625μmol/g 質(zhì)量,。

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC1370/BC1375  總巰基含量檢測試劑盒

BC1430/BC1435  非蛋白巰基含量檢測試劑盒

BC5800/BC5805  蛋白質(zhì)總巰基含量檢測試劑盒

BC5790/BC5795  蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測試劑盒

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