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淀粉脫分支酶（DBE）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
可見(jiàn)分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。
貨號(hào)：BC4250
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取1瓶加入3 mL試劑一，充分溶解后待用,，用不完的試劑2-8℃保存4周,；

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg無(wú)水*萄糖。臨用前加入1 mL蒸餾水溶解,，配成10 mg/mL葡萄糖溶液備用,，2-8℃可保存兩周。

產(chǎn)品說(shuō)明：
淀粉脫分支酶（starch debranching enzyme,，DBE）能夠?qū)Ｒ弧⒏咝У牧呀庵ф湹矸鄣?span style="font-family: Times New Roman, Times, serif;">α-1,6-糖苷鍵,，對(duì)淀粉的結(jié)構(gòu)起“修飾"的作用,，淀粉脫分支酶在調(diào)整支鏈淀粉側(cè)鏈的鏈長(zhǎng)方面起著關(guān)鍵作用，淀粉分支酶和淀粉脫分支酶的平衡使得支鏈淀粉合成,。

DBE催化支鏈淀粉產(chǎn)生還原糖,，其與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成棕紅色物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定其在540nm下吸光值變化可計(jì)算得DBE活性,。
 
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì),、臺(tái)式低溫離心機(jī),、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿,、可調(diào)式移液槍,、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水,、EP管,。
操作步驟：
一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1,、組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積（mL）為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后15000g,，4℃,，離心10min，取上清置于冰上待測(cè),。
2,、細(xì)胞或細(xì)菌：按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（10⁴個(gè)）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時(shí)間3min）,；然后15000g,，4℃，離心10min,，取上清置于冰上待測(cè),。
3、液體：直接檢測(cè),。（若溶液有渾濁則離心后取上清測(cè)定）
二,、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 將10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.5、0.4,、0.3,、0.2、0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用,。

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需200µL標(biāo)準(zhǔn)溶液,。

1. 取250μL樣本沸水浴5min（蓋緊，防止水分散失）,，冷卻至室溫后,，8000g，常溫離心5min,，取上清備用,。

2. 操作表 (在1.5mL離心管中) ：

注意：37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)2h后,，離心管底部可能有沉淀,，無(wú)需離心，直接進(jìn)入下一步試驗(yàn)即可,。
三,、DBE活性計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mg/mL）,。

1. DBE活性的計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：每mg蛋白每小時(shí)分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位,。
DBE酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=0.5x÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：每g樣本每小時(shí)分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位。
DBE酶活（U/g質(zhì)量）=x×V提取÷W÷T=0.5x÷W
（3）按細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算
酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位,。
DBE酶活（U/10⁴ cell）=x×V提取÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷T=0.5x÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）
（4）按液體體積計(jì)算
酶活定義：每mL樣本每小時(shí)分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位,。
DBE酶活（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T =0.5x
V提取：提取液體積,，1mL；V樣：加入的樣本體積,，0.2mL,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,，蛋白濃度自行測(cè)定,；W：樣本質(zhì)量，g,；T：反應(yīng)時(shí)間：2h,。
注意事項(xiàng)：

1. A大于1時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,。注意同步修改計(jì)算公式,。

2. 建議每次實(shí)驗(yàn)沸水浴后冷卻時(shí)間保持一致,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g大米，加入1mL提取液,，進(jìn)行冰浴勻漿,，然后15000g，4℃,，離心10 min,，取上清置于冰上待測(cè)，取上清后再用提取液稀釋10倍,，之后按照測(cè)定步驟操作,，測(cè)得計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.390-0.125=0.265，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.248x-0.1896,，計(jì)算x=0.202,，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

DBE酶活（U/g質(zhì)量）=0.5x÷W×10（稀釋倍數(shù)）=10.1 U/g質(zhì)量。
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC2040/BC2045  β-淀*酶（β-AL）活性檢測(cè)試劑盒
BC1850/BC1855  可溶性淀粉合成酶（SSS）活性檢測(cè)試劑盒
BC3290/BC3295  結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（GBSS）活性檢測(cè)試劑盒
BC1860/BC1865  淀粉分支酶（SBE）活性檢測(cè)試劑盒

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