目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC3315-100T/96S磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/96S |
| 貨號 | BC3315 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
| 主要用途 | 測定意義： PEPCK（EC 4.1.1.32）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和細 |
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC3315
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體18 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體18 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體62 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1,、 試劑二：臨用前加入15 mL試劑一溶解?？扇芙夂蠓盅b-20℃保存,，避免反復凍融。
2,、 試劑三：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管內(nèi),。臨用前加入蒸餾水按體積比1：120稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配,。
3,、 試劑四：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管內(nèi)。臨用前加入蒸餾水按體積比7：250稀釋,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。
4、 試劑五：粉劑置于試劑瓶內(nèi)玻璃管內(nèi),。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解,；可溶解后分裝-20℃保存，避免反復凍融,。
5,、 工作液的配制：將試劑二、試劑三,、試劑四按7:1:1（V:V:V）的比例配制工作液,，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配,。
產(chǎn)品說明：
PEPCK（EC 4.1.1.32）廣泛存在于動物、開花植物,、藻類,、部分真菌和細菌中,。該酶催化草酰乙酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸,，是調(diào)節(jié)糖異生途徑的第一限速酶。
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2,，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD+,，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性,。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀,、低溫離心機,、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板,、可調(diào)式移液槍,、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水,。
操作步驟：
一,、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿,，然后8000g，4℃,，離心10min,，取上清，置冰上待測,。
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率20%或200W，超聲3s,，間隔10s,，重復30次）；8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測,。
血清（漿）樣本：直接檢測。
二,、測定步驟
1,、 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零,。
2、 將工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱5分鐘,。
3,、 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列試劑：
試劑名稱 | 空白管 | 測定管 |
樣本（µL） | 10 | |
蒸餾水（µL） | 10 | |
工作液（µL） | 180 | 180 |
試劑五（µL） | 10 | 10 |
加入試劑五后立即混勻，于340nm處測定10s時的吸光值A1和1min10s時的吸光值A2,，計算ΔA測定管= A1測定-A2測定,，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管（空白管只需做1-2次）,。 | ||
三,、PEPCK酶活計算
A 按微量石英比色皿計算：
1、 按蛋白濃度計算
酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位,。
PEPCK酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr
2,、 按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。
PEPCK酶活（U/g 質(zhì)量）= ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=3215.4×ΔA÷W
3,、 按細菌或細胞數(shù)量計算
酶活定義：每104個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位,。
PEPCK酶活（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（500×V樣÷V樣總）÷T=6.43×ΔA
4、 按血清（漿）體積計算
酶活定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位,。
PEPCK（U/mL）＝ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷V樣÷T=3215.4×ΔA
ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V反總：反應體系總體積，0.0002L,；V樣：反應體系中樣本體積,，0.01mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,，蛋白濃度自行測定,；W：樣本質(zhì)量，g,，T：反應時間：1min,；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬；109：單位換算系數(shù),，1mol=109nmol,。
B 按96孔UV板計算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。
注意事項：
1,、 當A1小于1或ΔA大于0.6時（96孔UV板是當A1小于0.6或ΔA大于0.4時）,，建議將樣本稀釋適當倍數(shù)后再進行測定，以提高檢測靈敏度,。
2,、 酶活性高的樣本如動物肝,、腎等組織,，建議將提取液稀釋5倍或5倍以上測定,。
3、 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下,，變化不超過0.06。
4,、 加樣,、混勻等步驟要迅速，秒表計時要準確,。
實驗實例：
1,、 取0.1g肝臟加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后再用提取液稀釋2倍,，之后按照測定步驟操作,，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.1298-0.4464=0.6834，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.3819-1.3463=0.0356,，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.6834-0.0356=0.6478,，按樣本質(zhì)量計算酶活得：
PEPCK酶活（U/g質(zhì)量）= 3215.4×ΔA÷W×2（稀釋倍數(shù)）=3215.4×0.6478÷0.1×2=41658.72 U/g 質(zhì)量。
2,、 取0.1g蘆薈加入1mL提取液進行勻漿研磨,，取上清后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.4015-1.2665=0.135,，ΔA空白管= A1空白-A2空白=1.3819-1.3463=0.0356,，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.135-0.0356=0.0994，按樣本質(zhì)量計算酶活得：
PEPCK酶活（U/g質(zhì)量）= 3215.4×ΔA÷W=3215.4×0.0994÷0.1=3196.108 U/g 質(zhì)量,。
相關系列產(chǎn)品：
BC0730/BC0735 丙酮酸羧化酶（PC）活性檢測試劑盒
BC0920/BC0925 果糖-1,6-二磷酸（酯）酶（FBP）活性檢測試劑盒
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶檢測試劑盒 微量法 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶檢測試劑盒 微量法
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