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豚鼠腫瘤浸潤組織中性粒細胞分離液試劑盒
貨號:P2440
規(guī)格：200ml/kit
保存 ：室溫避光儲存,，有效期少 2 年,。
試劑盒內(nèi)容 ：
全血及組織稀釋液 100ml
細胞洗滌液 100ml
試劑A 100ml
試劑F 100ml
紅細胞裂解液 100ml
說明書 1 份
各種動物骨髓細胞的采集方法
1. 大鼠,、小鼠骨髓的采集：用頸椎脫臼法處死動物,剝離出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的F液,，沖洗出胸骨或股骨中全部骨髓液,，以500g（約1800 轉(zhuǎn)/分）離心20 分鐘，棄上清,。沉淀以F液重復(fù)洗滌一次后用全血及組織稀釋液懸起（細胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個/ml）,，備用。
2. 大動物骨髓的采集：
A．骨髓穿刺點定位
（1）胸骨：穿刺部位在胸骨中線,胸骨體與胸骨柄連接處,或選胸骨上1/3 部,。
（2）脛骨：穿刺部位在脛骨內(nèi)側(cè),脛骨上端的下方1 厘米處,。
（3）肋骨：穿刺部位在第5～7 肋骨各自的中點上。
（4）髁骨：穿刺部位在髁前上棘后2～3 厘米的髁嵴,。
（5）股骨：穿刺部位在股骨內(nèi)側(cè)面,靠下端的凹面處,。
B．骨髓穿刺方法
（1）實驗動物按要求固定，穿刺部位去毛,、消毒,、麻醉，要求局部麻醉范圍直達骨膜,，也可作全麻,。
（2）操作人員帶消毒手套，確定穿刺點,，估計從皮膚到骨髓的距離并依此固定骨髓穿刺針長度,。左手拇、食指繃緊穿刺點周圍皮膚,，右手持穿刺針在穿刺點垂直進針,，小弧度左右旋轉(zhuǎn)鉆入，當有落空感時表示針尖已進入骨髓腔,。用左手固定穿刺針,，右手抽出針芯，連接注射器緩慢抽吸骨髓組織,，當注射器內(nèi)抽到少許骨髓時立即停止抽吸,，收集骨髓細胞加入4-5ml F 液混勻，以500g（約1800 轉(zhuǎn)/分）離心20 分鐘,，棄上清,，沉淀以F 液重復(fù)洗滌兩次后用全血及組織稀釋液懸起（細胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個/ml），備用。
（3）左手壓住穿刺點周圍皮膚,，迅速拔出穿刺針,，用棉球壓迫數(shù)分鐘。如穿刺的是肋骨,，除壓迫止血外,，還需膠布封貼穿刺點，防止發(fā)生氣胸,。
3. 人骨髓的采集：
臨床方法收集骨髓細胞加入4-5ml F液混勻,，以500g（約1800轉(zhuǎn)/分）離心20分鐘，棄上清,，沉淀以F液重復(fù)洗滌兩次后用含20%胎牛血清的全血及組織稀釋液懸起（細胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個/ml）,，備用。
人或各種動物骨髓中性粒細胞分離液試劑盒
1．取 1ml 骨髓細胞懸液（制備方法詳見“一,、骨髓細胞的采集方法”）小心疊加在A 液之液面上（比例為1：1）,，20℃±2℃，500g（約1800 轉(zhuǎn)/分）,，離心25 分鐘（半徑15cm 水平轉(zhuǎn)子）,。
此時離心管中由上下細胞分四層。*層;為稀釋液層,。第二層,；為環(huán)狀乳白色的單個核細胞層。第三層,；為略帶渾濁的分離液層（富集一定量的中性粒細胞）,。第四層；為紅細胞層,。棄去*層血漿層及第二層細胞,，收集第三層細胞和第四層紅細胞層，放入含細胞洗滌液10毫升的試管中,，充分混勻后,，以500g（約1800 轉(zhuǎn)/分）離心30分鐘。沉淀經(jīng)1次洗滌后用紅細胞裂解液裂解紅細胞,，再經(jīng)3次洗滌去除紅細胞內(nèi)容物和碎片后取沉淀細胞即為所需中性粒細胞,。
注： 提取率約為80%。
2. 紅細胞裂解過程詳見“三,、紅細胞裂解液使用說明”,。
分離圖例：
三 ,、 紅細胞裂解液使用說明
紅細胞裂解液配方經(jīng)過本公司優(yōu)化,，在裂解紅細胞的同時不損傷并在一定程度上保護淋巴細胞(lymphocyte)或其它有細胞核的細胞，所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態(tài),。另外,，本裂解液中無 DNA 及 RNA 酶,，配合細胞分離液使用所提細胞可廣泛用于細胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實驗。
紅細胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer),，也稱 ACK Lysis Buffer,，是一種用于從人或鼠等的血液或組織細胞樣品中裂解并去除無細胞核紅細胞的溶液。本裂解液不適用于有細胞核紅細胞的裂解,，例如鳥或禽類的紅細胞,。本裂解液經(jīng)過無菌處理，處理過的血液或組織細胞樣品可以用于后續(xù)的原代培養(yǎng),、細胞融合以及核酸或蛋白的提取及各種常規(guī)的分析和檢測,。
使用說明：
A. 對于組織細胞樣品 ：
a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當方法分散成細胞懸液,，離心棄上清,。
b. 加入 3-5 倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻,，裂解 1-2 分鐘,。例如細胞沉淀的體積為 1ml，則加入 3-5ml 的紅細胞裂解液,。本步驟在室溫或 4 度操作均可,。
c. 400-500g 離心 5 分鐘，棄紅色上清,。4℃離心效果更佳,。
d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟 b 和步驟 c 一次,。通常極微量的紅細胞不會影響后續(xù)的一些檢測,。
e. 洗滌 1-2 次：加入適量 PBS、HBSS,、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液,，重懸沉淀，400-500g 離心 2-3 分鐘,，棄上清,。可再重復(fù) 1 次,，共洗滌 1-2 次,。洗滌液的用量通常應(yīng)少為細胞沉淀體積的 5 倍。4℃離心效果更佳,。
f. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗,。
B. 對于組織細胞樣品無需洗滌的快速操作步驟 ：
a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當方法分散成細胞懸液，離心棄上清,。
b. 對于 0.2ml 細胞沉淀加入 1ml 紅細胞裂解液,，輕輕吹打混勻，裂解 1-2 分鐘,。本步驟在室溫或 4 度操作均可,。
c. 加入 15-20ml PBS、HBS S,、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液,，混勻。
d. 400-500g 離心 5 分鐘,，棄紅色上清,。4℃離心效果更佳。
e. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*,，可以重復(fù)上述步驟 2 和步驟 3 一次,。通常極微量的紅細胞不會影響后續(xù)的一些檢測。
f. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗,。
注：對于常規(guī)步驟,，多一步洗滌過程中的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量,，并且洗滌效果也更好一些,，同時不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心,，但洗滌效果略差一些，同時需要大體積的離心管,。
C. 對于血液樣品 ：
a. 取新鮮抗凝血,，400-500g 離心 5 分鐘，離心棄上清,。
b. 加入 6-10 倍細胞體積的紅細胞裂解液,，輕輕吹打混勻，裂解 1-2 分鐘,。例如細胞沉淀的體積為 1ml,，則加入 6-10ml 的紅細胞裂解液。本步驟在室溫或 4 度操作均可,。注意：對于鼠的血液,，裂解 1-2 分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外周血,，宜延長裂解時間 4-5 分鐘,，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解,。
c. 400-500g 離心 5 分鐘，棄紅色上清,。4℃離心效果更佳,。
d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*,，可以重復(fù)上述步驟 2 和步驟 3 一次,。通常極微量的紅細胞不會影響后續(xù)的一些檢測。
e. 洗滌 1-2 次：加入適量 PBS,、HBSS,、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀,，400-500g 離心 2-3 分鐘,，棄上清?？稍僦貜?fù) 1 次,，共洗滌 1-2 次。洗滌液的用量通常應(yīng)少為細胞沉淀體積的 5 倍,。4℃離心效果更佳,。
f. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。
注：對于微量或少量的血液樣品,，可以在*步中不進行離心棄上清的操作,，直接在第二步中加入 10 倍血液體積的紅細胞裂解液，并在室溫或 4 ℃裂解 4 -5 分鐘,。對于鼠的血液,，裂解 4-5 分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外周血,，宜延長裂解時間 10 分鐘,，但通常不宜超過 15 分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解,。后續(xù)步驟相同,。
D. 對于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟 ：
a. 每 1ml 新鮮抗凝血中加入 10 ml 紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻,，裂解 4-5 分鐘,。本步驟在室溫或 4 度操作均可。注意：對于鼠的血液,，裂解 4-5 分鐘已經(jīng)足夠,，對于人的外周血，宜延長裂解時間 10 分鐘,，但通常不宜超過 15 分鐘,，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解,。
b. 加入 20-30ml PBS、HBSS,、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液,，混勻。
c. 400-500g 離心 5 分鐘,，棄紅色上清,。4℃離心效果更佳。
d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*,，可以重復(fù)上述步驟 2 和步驟 3 一次,。通常極微量的紅細胞不會影響后續(xù)的一些檢測。
e. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗,。
注：對于常規(guī)步驟,，多一步洗滌過程的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量,，并且洗滌效果也更好一些,，同時不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心,，但洗滌效果略差一些，同時需要大體積的離心管,。
四 ,、 注意事項
A． 本分離液是敏光型的，在運輸和貯藏過程中應(yīng)在18℃-25℃避光保存,，啟封后置4℃保存避免微生物污染,。另外，本品為真空包裝,，未啟封前置于10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶,，影響分離效果。
B． 待分離的樣本要求新鮮,，避免冷凍和冷藏,。分離液和所分離樣本一定在20℃水浴箱中復(fù)溫20 分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果好，且所有操作過程一定要在無菌條件下進行,。
C． 由于各品牌離心機的性能不同,，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響分離效果,，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù),，調(diào)節(jié)離心的時間，摸索的分離條件（具體分離條件各實驗室自定）,。
D． 好使用無靜電反應(yīng)的離心管,，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管,。
五 、 產(chǎn)品性能指標
pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內(nèi)毒素 ≤0.5EU/ml
無菌 直接接種培養(yǎng)14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每50ml 溶液中含10µm 以上的不溶性微粒20 粒以下,，
含25µm 以上的不溶性微粒5 粒以下
六 ,、 貯藏及保存期限
18℃-25℃避光保存，有效期兩年,。啟封后置4℃保存,，有效期一周。
注：若保證無微生物污染,，啟封后可置4℃長期保存,。但應(yīng)注意保存溫度較低時本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,，影響分離效果,。
豚鼠腫瘤浸潤組織中性粒細胞分離液試劑盒訂購說明：
1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨,，一般情況下都能訂貨當日發(fā)貨,。
2、部分非常用產(chǎn)品,，需提前1－2日預(yù)訂,，海外期貨則需要提前3-6周預(yù)訂。
3,、部分產(chǎn)品價格會因貨期,、批次等因素發(fā)生變化，若有變動以訂貨當日新價格為準,。
4,、每日訂單截止時間為16點整，部分城市可到17點整,，因超過截止時間造成當日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨,。
5、請辦理完貨款后,，將收據(jù),、底單等連同收貨人的地址、姓名,、等以傳真,、、短信,、等形式通知我們,。
運輸說明：
1、極低溫產(chǎn)品：極低溫產(chǎn)品運輸過程中加裝干冰運輸,。用干冰把產(chǎn)品包裹起來,，再用泡沫盒密封,，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子,，然后交付給合作快遞,，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一,，為您的實驗保駕護航,。
2、低溫產(chǎn)品：低溫產(chǎn)品運輸過程中加裝索萊寶冰袋運輸,。事先用冰袋把產(chǎn)品包裹起來,，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴實密封泡沫盒,，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續(xù)一周）,，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中,，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一,，為您的實驗保駕護航。
3,、常溫產(chǎn)品：常溫產(chǎn)品運輸過程中無需加冰或者特殊包裝,。產(chǎn)品由公司庫房人員快速配貨，準確快速高效的快遞保證產(chǎn)品快速送達您的手中,。
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