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乙醇脫氫酶（ADH）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動,，請注意并嚴格按照該說明書操作,。
貨號：BC1085
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1. 提取液：臨用前將粉劑一倒入提取液中,，溶液為懸濁液，使用前需搖勻,；

2. 試劑二：臨用前取1支試劑二加入1mL蒸餾水,，可以-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融,。1支即可做100T,，為延長試劑盒使用時間，遂多給一支,。

產(chǎn)品說明：
ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶,，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過程中起著重要作用,。哺乳動物ADH主要在肝臟生成,，肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常,。
ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺,，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD⁺沒有,；測定340nm 吸光度下降速率,，來計算ADH活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。
需自備的儀器和用品：
冰、低溫離心機,、紫外分光光度計/酶標儀,、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔板（UV板）,、可調(diào)式移液器,、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水,。
操作步驟：
一,、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1,、 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿。16000g,，4℃離心20min,，取上清置冰上待測,。
2、 細菌,、細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300W，超聲3秒,，間隔7秒,，總時間3min）；16000g,，4℃離心20min,，取上清液置冰上待測。

3,、血清等液體：直接測定,。
二、測定步驟

1. 紫外分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長到340nm,，紫外分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一在25℃水浴中保溫30min以上,。

3. 空白管：在微量石英比色皿//96孔板（UV板）中依次加入20μL蒸餾水,、8μL試劑二、152μL試劑一和20μL試劑三,，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化,，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A1和A2,。ΔA空白管=A1-A2,。（空白管只需做1~2個）

4. 測定管：在微量石英比色皿//96孔板（UV板）中依次加入20μL上清液、8μL試劑二,、152μL試劑一和20μL試劑三,，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值,，分別記為A3和A4,。ΔA測定管=A3-A4。

三,、ADH活性計算
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位,。
ADH (U/mg prot) =[(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷(Cpr×V樣)÷T
              =1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管) ÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位。
ADH (U/g 質(zhì)量) =[(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
              =1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管)÷W
（3）按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：25℃中每10⁴個細胞每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位,。
ADH (U /10⁴ cell) = [(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管) ÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位,。
ADH (U/mL) = [(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷V樣÷T=1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管)
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積,，200μL=2×10^-4L,；10⁶：單位換算系數(shù)，1mol=1×10⁶μmol,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL,；V樣總：提取液體積,，1mL；T：反應(yīng)時間,，1min,；細胞數(shù)量：以萬計。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位,。
ADH (U/mg prot) =[(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷(Cpr×V樣)÷T
               =2.68×(ΔA測定管–ΔA空白管) ÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位,。
ADH (U/g 質(zhì)量) =[(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
              =2.68×(ΔA測定管–ΔA空白管)÷W



（3）按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：25℃中每10⁴個細胞每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位。
ADH (U/10⁴ cell) = [(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
  =2.68×(ΔA測定管–ΔA空白管) ÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位,。
ADH (U/mL) = [(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷V樣÷T=2.68×(ΔA測定管–ΔA空白管)
ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑,，0.6cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4L,；10⁶：單位換算系數(shù),，1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,，需要自行測定；W：樣本質(zhì)量,，g,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL,；V樣總：提取液體積,，1mL；T：反應(yīng)時間,，1min,；細胞數(shù)量：以萬計,。
注意事項：

1. 若A3大于1.5或者A3小于A1，則需要將樣本用蒸餾水稀釋再進行測定,，計算公式注意乘以稀釋倍數(shù),。

實驗實例：

1. 取0.1g大鼠肝臟加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作,，用微量石英比色皿測得計算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007,，ΔA測定管=A3-A4=0.8351-0.5341=0.301，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

ADH (U/g 質(zhì)量) =1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管)÷W=1.61×(0.301-0.007)÷0.1=4.7334 U/g 質(zhì)量,。

1. 取馬血清直接檢測,，用微量石英比色皿測得計算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007，ΔA測定管=A3-A4=0.6369-0.6036=0.0333,，按液體體積計算酶活得：

ADH ((U/mL) =1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管)=1.61×(0.0333-0.007)=0.042343 U/mL,。

1. 取小鼠血漿直接檢測，用微量石英比色皿測得計算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007,，ΔA測定管=A3-A4=0.7381-0.7093=0.0288,，按液體體積計算酶活得：

ADH (U/mL) =1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管)=1.61×(0.0288-0.007)=0.035098 U/mL。
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0590/BC0595 游離脂肪酸（FFA）含量檢測試劑盒
BC2340/BC2345 脂肪酶（LPS）活性檢測試劑盒
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BC0750/BC0755 乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒

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