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人促血管生成素配體4ELISA試劑盒

注意事項： 

1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑,。

2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱,，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄,。

3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品,。

4. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測,，且加入試劑的順序應(yīng)保持*,。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管,，槍頭,，封板膜（※）及潔凈塑料容器,。.

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上,，使用前請離心處理（5-10 S 即可）,，使管壁上的液體集中在管底部，取用時,，請用移液器小心吹 打幾次,。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的 試劑代替本試劑盒中的某單個組分,。 8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確,，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。 

安全提示： 

試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護(hù),；在操作過程中也要避免試 劑接觸皮膚和眼睛,，如果不慎接觸,，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時,，請按國家生物 實驗室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行,。

自備實驗器材（不提供,，可代購） 

1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機(jī)或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水,，去離子水，量筒等

6． 稀釋用聚丙烯試管 

人促血管生成素配體4ELISA試劑盒

樣本收集及儲存： 

1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清： 將細(xì)胞培養(yǎng)基移無菌離心管,，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并 于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融,。

2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后,，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于 -20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，保存過程中如有沉淀，請再次離心,，避免反復(fù)凍融,。

3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實際要求選擇 EDTA,，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混 合 20 min,，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融,。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本,，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高 于標(biāo)準(zhǔn)品的值,，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測,，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù),。 

試劑準(zhǔn)備： 

1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下,，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶,，請放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解,。

2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋 成 1 倍應(yīng)用液,，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存,。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,，靜置15分鐘待其*溶解后輕 輕混勻(濃度為80ng/ml)，然后在其余七管中各加入500?L標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）,，按照以下濃度進(jìn) 行2倍稀釋：80,、40,、20、10,、5,、2.5、1.25,、0 ng/ml進(jìn)行稀釋,。80ng/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線點濃度，標(biāo)準(zhǔn) 品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點（0ng/ml）,。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（80ng/ml）未用完的應(yīng)廢 棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱,，具體如下圖,。

6. 洗滌方法：

? 自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干,，注入洗滌液為 300ul/孔,注入與吸出 間隔為 30 秒，洗板 5 次,。

? 手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干,，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔,，靜止 30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次,。

人促血管生成素配體4

結(jié)果判斷： 

1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值,。選擇雙波長檢測,，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測,，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

2.計算標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值

3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo),，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，樣品中Human Angiopoietin-like 4 含 量可通過對應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測,，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù),。

2. 靈敏度：

低可檢測人 Human Angiopoietin-like 4 濃度達(dá) 0.5ng/ml， 20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差,，計算相應(yīng)的可檢測濃度,。

3. 特異性：

不與人 Angiopoietin-1,、Angiopoietin-2、Angiopoietin-4,、Angiopoietin-like 3 反應(yīng),，小鼠 Angiopoietin-3,、 Angiopoietin-like 3 反應(yīng)。

4. 重復(fù)性： 板內(nèi),，板間變異系數(shù)<10%,。