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人可溶性細(xì)胞間粘附分子3 ELISA試劑盒

注意事項(xiàng)： 
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請(qǐng)不要使用過期的試劑,。 
2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱,，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請(qǐng)丟棄,。 
3. 試劑盒使用前請(qǐng)?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min,，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。 
4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測(cè),，且加入試劑的順序應(yīng)保持*,。 
5. 為避免交叉污染，請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管,，槍頭,，封板膜（※）及潔凈塑料容器,。. 
6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少,，在運(yùn)輸過程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請(qǐng)離心處理（5-10 S 即可）,，使管壁上的液體集中在管底部,，取用時(shí)，請(qǐng)用移液器小心吹 打幾次,。 
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外,，請(qǐng)不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的 試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。 
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確,，每次檢測(cè)均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。 
 

安全提示： 
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時(shí)請(qǐng)帶上手套并注意防護(hù),；在操作過程中也要避免試 劑接觸皮膚和眼睛,，如果不慎接觸，請(qǐng)用大量清水清洗,；檢測(cè)血液樣本及其它體液樣本時(shí),，請(qǐng)按國家生物 實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供,可代購） 
1． 酶標(biāo)儀（主波長(zhǎng) 450nm,參考波長(zhǎng) 630nm） 
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl 
3． 洗板機(jī)或洗瓶 
4． 37℃孵育箱 
5． 雙蒸水,去離子水,量筒等 
6． 稀釋用聚丙烯試管 
 

人可溶性細(xì)胞間粘附分子3 ELISA試劑盒

樣本收集及儲(chǔ)存： 
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清： 將細(xì)胞培養(yǎng)基移無菌離心管,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于 -20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存）,避免反復(fù)凍融,。 
2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固20 min后,在4℃條件下1000×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃ 下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存）,保存過程中如有沉淀,請(qǐng)?jiān)俅坞x心,避免反復(fù)凍融,。 
3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中,根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA,檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合 20 min,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢 測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存）,避免反復(fù)凍融。 
※注意：
血清血漿樣本避免使用溶血,、高血脂樣本,以免影響檢測(cè)結(jié)果,；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測(cè)濃度高于 標(biāo)準(zhǔn)品的值,請(qǐng)將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測(cè),建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。 
 

試劑準(zhǔn)備： 
1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測(cè)樣本放置于室溫下,，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶,，請(qǐng)放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積,，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋 成 1 倍應(yīng)用液,，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。 

3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）0.5ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,，靜置15分鐘待其*溶解后 輕輕混勻(濃度為4000pg/ml),，然后按照以下濃度進(jìn)行2倍稀釋：4000、2000,、1000,、500、250,、125,、62.5pg/ml 進(jìn)行稀釋，4000pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)濃度,，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點(diǎn)（0pg/ml）,。 復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（4000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～ -80℃冰箱,，具體如下圖,。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測(cè)稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍 應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻）,，請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中,。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心）,，請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。

6. 洗滌方法：

? 自動(dòng)洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干,，注入洗滌液為 300ul/孔,，注 與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次,。

? 手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干,，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔,，靜止 30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干,，洗板 5 次

人可溶性細(xì)胞間粘附分子3

結(jié)果判斷： 
1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定 OD 值。選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè),，參考波長(zhǎng)為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè),，請(qǐng) 用 450 nm 的 OD 測(cè)定值減去 630 nm 的 OD 測(cè)定值,。 
2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品的平均 OD 值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值。 
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，樣品中ICAM-3含量可通過對(duì)應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度,。 
4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè),，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。

2. 靈敏度： 
低可檢測(cè)人 ICAM-3 濃度達(dá) 30pg/ml,， 20 個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,，計(jì)算相應(yīng)的可檢測(cè)濃度,。

3. 特異性：
 不與人 CD31/PECAM-1、E-Selectin/Fc Chimera,、ICAM-1/Fc Chimera、ICAM-2/Fc Chimera,、L-Selectin/Fc Chimera,、P-Selectin/Fc Chimera 、VCAM-1 等反應(yīng),。 
4. 重復(fù)性： 
板內(nèi),，板間變異系數(shù)<10%。 
5. 回收率： 
在選取的健康人血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的人 ICAM-3,，計(jì)算回收率。

6. 線性稀釋：

分別在選取的 4份健康人血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人ICAM-3,，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋， 評(píng)估線性,。

ICAM-3 ELISA KIT（Human）