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人趨化因子CC配體5 ELISA試劑盒

注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內(nèi)使用,，請不要使用過期的試劑,。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱,，已復溶但未用完的標準品，請丟棄,。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min,，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測,，且加入試劑的順序應保持*,。
5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管,，槍頭,，封板膜（※）及潔凈塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少,，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上,，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部,，取用時,，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外,，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分,。
8. 為保證結(jié)果準確，每次檢測均需做標準曲線,。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液,，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛,，如果不慎接觸,，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時,，請按國家生物實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行,。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm,，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水,，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

人趨化因子CC配體5 ELISA試劑盒

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養(yǎng)上清：
將細胞培養(yǎng)基移無菌離心管,，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后,，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀,，請再次離心,，避免反復凍融,。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標本的實際要求選擇 EDTA,，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血,、高血脂樣本,，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的值,，請將樣品做適當倍數(shù)稀釋后檢測,，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數(shù)。

試劑準備：
1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒,，待測樣本放置于室溫下,，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解,。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積,，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存,。
3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標準品中,，靜置15分鐘待其*溶解后輕 輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后在其余七管中各加入500uL標準品/樣本稀釋液（SR1）,，按照以下濃度 進行2倍稀釋：500（250ul標準品原液+750ul標準品稀釋液）,、250、125,、62.5,、31.2、15.625,、7.8,、0 pg/ml 進行稀釋。500pg/ml標準曲線點濃度,，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點（0pg/ml）。 復溶過的標準品原液（2000pg/ml） 未用完的應廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝,，并將其貯存在-20～-80℃冰箱,，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量,，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻）,，請在30分鐘內(nèi)加入到反應孔中,。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應用工作液（稀釋前離心）,，請在30分鐘內(nèi)使用,。

6. 洗滌方法： 

自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干,，注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒,，洗板 5 次。 

手工洗板：甩盡酶標板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干,，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩 凈酶標板孔中液體,，在厚迭的吸水紙上拍干,，洗板 5 次。

人趨化因子CC配體5結(jié)果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值,。選擇雙波長檢測,，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測,，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值,。

2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值

3.以標準品濃度為橫坐標,，吸光度OD值為縱坐標,，用軟件繪制標準曲線，樣品中CCL5/Rantes含量可通過對應OD 值由標準曲線換算出相應的濃度,。

4.若標本 OD 值高于標準曲線上限,，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù),。

1. 數(shù)據(jù)及標準曲線

本圖僅供參考,，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人CCL5/Rantes的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 CCL5/Rantes 濃度達 15pg/ml，
20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差,，計算相應的可檢測濃度,。

3. 特異性：
不與人 GCP、 GROα,、 GROβ,、 GROγ、 IFN-γ ,、IL-8 ,、SDF-1α、 SDF-1β反應,，小鼠 BLC/BCA-1,、 CRG-2 (IP-10),、 GM-CSF等反應。

4. 重復性：
板內(nèi),，板間變異系數(shù)<10%,。

5. 回收率：
在選取的健康人血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的人 CCL5/Rantes,，計算回收率,。

6. 線性稀釋：

分別在選取的 4 份健康人血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人CCL5/Rantes，在標準曲線動力學范圍內(nèi)進行稀 釋,，評估線性,。

 CCL5 ELISA KIT（Human）