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人CD40配體ELISA試劑盒

注意事項：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑,。
2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱,，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄,。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù) 30 min,，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測,，且加入試劑的順序應(yīng)保持*,。
5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管,，槍頭,，封板膜（※）及潔凈塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少,，在運(yùn)輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上,，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部,，取用時,，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外,，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分,。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液,，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護(hù),；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸,，請用大量清水清洗,；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行,。

自備實驗器材（不提供,，可代購）
1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm,，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機(jī)或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水,，去離子水,，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

人CD40配體ELISA試劑盒

樣本收集及儲存：
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移無菌離心管,，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，避免反復(fù)凍融,。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后,，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，保存過程中如有沉淀,，請再次離心，避免反復(fù)凍融,。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中,，根據(jù)標(biāo)本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合 20 min ,，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，避免反復(fù)凍融,。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本,，以免影響檢測結(jié)果,；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測,，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù),。

試劑準(zhǔn)備：
1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下,，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶,，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積,，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液,，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存,。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕 輕混勻(濃度為2000pg/ml),，然后按照以下濃度進(jìn)行2倍稀釋：1000,、500、250,、125,、62.5、31.25,、15.625pg/ml 進(jìn)行稀釋,，1000pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線點濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點（0pg/ml）,。 復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝,，并將其貯存在-20～ -80℃冰箱，具體如下圖,。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量,，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中,。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制,，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用,。

6. 洗滌方法： 

自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒,，洗板 5 次。 

手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干,，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩 凈酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭的吸水紙上拍干,，洗板 5 次。

人可溶性CD40配體

結(jié)果判斷：

1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值,。選擇雙波長檢測,，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測,，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值,。

2.計算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值

3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),，吸光度OD值為縱坐標(biāo),，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中 CD40Ligand 含量可通過對應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測,，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。

參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

本圖僅供參考,，應(yīng)以當(dāng)次試驗標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算人CD40Ligand 的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 CD40Ligand 濃度達(dá) 8pg/ml,，
20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差，計算相應(yīng)的可檢測濃度,。

3. 特異性：
不與人 BDNF,、 CD4 、CD40 ,、CNTF,、 CT-1、 CTLA-4,、 Epo,、 Fas 、GDNF,、IL-2,、 IL-3、 IL-4 ,、 IL-5,、 IL-6，小鼠 Fas Ligand ,、GITR Ligand,、IFN-γ、 IL-1α ,、IL-1β ,、IL-1ra 、IL-2 ,、IL-3 等反應(yīng),。

4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%,。

5. 回收率：
在選取的健康人血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的人 CD40Ligand，計算回收率,。

6. 線性稀釋：

分別在選取的 4 份健康人血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人 CD40Ligand,，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀 釋，評估線性,。

sCD40L ELISA KIT（Human）