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人白細胞介素8（IL-8/CXCL8）ELISA試劑盒注意事項：

1.試劑盒應在有效期內(nèi)使用,，請不要使用過期的試劑。
2.試劑盒未使用時應保存在2-8℃冰箱,，已復溶但未用完的標準品,，請丟棄。
3.試劑盒使用前請在室溫恢復30 min,，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品,。
4.在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*,。
5.為避免交叉污染,，請在試驗中使用1次性試管，槍頭,，封板膜（※）及潔凈塑料容器,。.
6.濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上,，使用前請離心處理（5-10 S即可）,，使管壁上的液體集中在管底部，取用時,，請用移液器小心吹打幾次,。
7.除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分,。
8.為保證結(jié)果準確,，每次檢測均需做標準曲線。

 

人白細胞介素8ELISA KIT安全提示：

試劑盒中的終止液為酸性溶液,，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護,；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸,，請用大量清水清洗,；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行,。

自備實驗器材（不提供,，可代購）

1．酶標儀（主波長450nm，參考波長630nm）
2．高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3．洗板機或洗瓶
4．37℃孵育箱
5．雙蒸水,，去離子水,，量筒等
6．稀釋用聚丙烯試管

 

樣本收集及儲存：
1.細胞培養(yǎng)上清：
將細胞培養(yǎng)基移無菌離心管,，在4℃條件下1000 ×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），避免反復凍融,。
2.血清樣本：
室溫血液自然凝固20 min后,，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存）,，保存過程中如有沉淀,，請再次離心，避免反復凍融,。
3.血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中,，根據(jù)標本的實際要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合20 min,，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存）,，避免反復凍融,。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本,，以免影響檢測結(jié)果,；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的值，請將樣品做適當倍數(shù)稀釋后檢測,，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數(shù),。

白細胞介素8試劑準備：

1.試劑回溫：首先在實驗前30 min將試劑盒，待測樣本放置于室溫下,，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解,。
2.配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積,，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存,。
3.標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標準品中,，靜置15分鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度為1000pg/ml)，然后在濃度為400pg/ml的EP管中加入600?L標準品/樣本稀釋液（SR1）,，再加入400?L 1000pg/ml標準品原液,，以獲得標準曲線的點濃度400pg/ml。后,，在其余六管中各加入500?L標準品/樣本稀釋液（SR1）,，按照以下濃度進行2倍稀釋：200、100,、50,、25,、12.5、6.25pg/ml進行稀釋,。標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點（0pg/ml）,。復溶過的標準品原液（1000pg/ml）未用完的應廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱,，具體如下圖,。

4.生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻）,，請在30分鐘內(nèi)加入到反應孔中,。

5.酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心）,，請在30分鐘內(nèi)使用,。



6.洗滌方法：
?自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干,，注入洗滌液為300ul/孔,注與吸出間隔為30秒,，洗板5次。
?手工洗板：甩盡酶標板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干,，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔，靜止30秒后甩凈酶標板孔中液體,，在厚迭的吸水紙上拍干,，洗板5次。
 

結(jié)果判斷：
1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值,。選擇雙波長檢測,，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測,，請用 450 nm 的OD測定值減去630 nm的OD測定值,。
2.計算標準品、樣品的平均OD值：每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值
3.以標準品濃度為橫坐標,，吸光度OD值為縱坐標,，用軟件繪制標準曲線，樣品中IL-3含量可通過對應OD值由標準曲線換算出相應的濃度,。
4.若標本OD值高于標準曲線上限,，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù),。

人白細胞介素8參數(shù)表征：

1.數(shù)據(jù)及標準曲線

本圖僅供參考,，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人IL-8的樣本含量
 

2. 靈敏度：
低可檢測人IL-8濃度達3pg/ml
20個零標準品濃度OD的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度,。

3. 特異性：
不與人G-CSF,、GM-CSF,、IL-1α、IL-1β,、IL-2,、IL-3 Rα、IL-3 Rβ,、IL-4 IL-6,、IL-7、IL-8,、TGF-β1  ,、TNF-α、 TNF-β反應,，小鼠GM-CSF,、IL-1β、 IL-3,、IL-4 ,、IL-5、IL-6,、IL-7等反應,。

4. 重復性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%,。

5. 回收率：
在選取的健康人血漿,、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的人 IL-8，計算回收率,。

6. 線性稀釋：
分別在選取的4 份健康人血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人 IL-8,，在標準曲線動力學范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性,。

人白細胞介素8（IL-8/CXCL8）ELISA試劑盒常見問題及解決方法：