糖原磷酸化酶a (GPa)活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC3340

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入1.25 mL蒸餾水,，充分混勻,；2-8℃保存2個月；可分裝后-20℃保存4周,，避免反復凍融,；

2、 

3,、 試劑三：臨用前加入1.25 mL蒸餾水,，充分混勻；可分裝后-20℃保存4周,，避免反復凍融,；

4、 試劑四：臨用前加入1.25mL蒸餾水,，充分混勻,；可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融,；

5,、 試劑五：臨用前取一支加入1 mL蒸餾水，充分混勻,；可分裝后-20℃保存4周,，避免反復凍融；

6,、 試劑六：臨用前取一支加入1 mL蒸餾水,，充分混勻；可分裝后-20℃保存4周,，避免反復凍融,；

7、 工作液的配制：臨用前根據(jù)實驗所需用量,，按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：蒸餾水=740μL: 20μL: 20μL: 20μL: 50μL（1T的量）的比例,，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

產(chǎn)品說明：

糖原磷酸化酶是糖原分解代謝中的關鍵酶,，催化糖原的磷酸化反應。該酶分為有活性的糖原磷酸化酶a（Glycogen phosphorylase a, GPa）和無活性的糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b, GPb）兩種形式,。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶a的催化下進行,。未添加激活劑時,，糖原磷酸化酶a催化糖原和無機磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步依次催化NADP還原生成NADPH,，在340nm下測定NADPH上升速率,，即可反映糖原磷酸化酶a活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、低溫離心機,、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋,、電子天平、可調(diào)式移液器,、研缽/勻漿器,、1 mL石英比色皿、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1,、組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織,，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿，然后8000 g,，4℃,，離心10 min，取上清置于冰上待測,。

2,、細菌或者細胞：先收集細胞或細菌樣本到離心管內(nèi)，棄上清,，按照每500萬細胞或細菌加入1mL提取液,，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，超聲3s,，間隔10s,，重復30次）。8000g,，4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

3、血清（漿）：直接檢測,。若有渾濁可以離心后取上清進行測定,。

二,、測定步驟

1、 紫外分光光度計預熱30 min以上,，調(diào)節(jié)波長至340 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 臨用前工作液置于37℃預熱5min,。

在石英比色皿中依次加入50 μL 樣本、50 μL試劑五,、50 μL試劑六,、850 μL工作液，充分混勻10s,，記錄340nm處10s時吸光值A1,，37℃水浴鍋或者恒溫培養(yǎng)箱反應10min，反應后拿出迅速擦干測定10min10s時吸光值A2,。計算ΔA = A2- A1,。

三、 糖原磷酸化酶a (GPa)活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。

GPa（U/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。

GPa（U/g 質(zhì)量）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=321.54×ΔA÷W

3. 按樣本體積計算

單位定義：每mL液體每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位

GPa（U/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷V樣÷T=321.54×ΔA

4. 按細胞數(shù)量計算

單位定義：每1萬個細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

GPa（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=321.54×ΔA÷細胞數(shù)量

V反總：反應體系總體積,，1×10^-3 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.05 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應時間,，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；細胞數(shù)量：以萬計,；10⁹：換算單位，1mol=10⁹ nmol,。

注意事項：

1,、如果測定吸光值ΔA＞0.8,，建議稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù),；如果測定吸光值較低或接近空白OD值,，建議增加反應中的樣本體積或者樣本質(zhì)量后再進行測定。

實驗實例：

1. 稱取0.1 g兔子肝臟組織,，加入1 mL提取液,，冰浴勻漿，8000 g,，4℃條件下離心10 min,；取上清置于冰上待測。按照測定步驟操作,，計算ΔA=A2-A1=0.414-0.318=0.096,，按公式計算活性：
GPa（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=321.54×0.096÷0.1 =308.68 U/g 質(zhì)量

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