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動物組織6-磷酸葡萄糖（G6P）含量檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5965

規(guī)格：100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前將試劑一A全部溶于試劑一B,，充分溶解后使用,，未用完的試劑2-8℃保存4周（試劑顏色由透明變至淡黃色為正常現(xiàn)象,，可正常使用）,，禁止放-20℃保存。

2,、 試劑二：臨用前加入0.5mL蒸餾水充分溶解,，未用完的試劑-20℃分裝保存4周,，避免反復凍融,。

3,、 試劑三：臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周,，避免反復凍融（該試劑為凍干試劑,，可能存在肉眼觀察不同瓶內試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象，此現(xiàn)象不影響使用,，實際質量相同）,。

4、 試劑三工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑三：蒸餾水=3μL：12μL（共15μL,，約4T）的比例配制后使用,，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5,、 標準品：臨用前加入1.645mL蒸餾水充分溶解成20μmol/mL 6-磷酸葡萄糖標準品,，2-8℃保存4周。

6,、 0.5μmol/mL標準品配制：取25μL 20μmol/mL 6-磷酸葡萄糖標準品,，加975μL蒸餾水充分溶解成0.5μmol/mL 標準品進行測定，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

7,、 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑一：試劑二：試劑三工作液=870μL：15μL：15μL（共900μL，約4T）配成工作液后使用,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

產品說明：

6-磷酸葡萄糖（Glucose-6-Phosphate，G6P）,，又稱葡萄糖-6-磷酸,，是糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間產物，廣泛存在于動植物體和微生物中,。在糖酵解的第一步反應中,，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通過磷酸葡萄糖異構酶的催化形成果糖-6-磷酸,，以繼續(xù)糖酵解的其它步驟,；而在戊糖磷酸途徑中，葡萄糖-6-磷酸是其第一個底物,，該過程也是生成NADPH的主要途徑,。此外，葡萄糖-6-磷酸也能轉化形成糖原或淀粉而被儲存起來,。

6-磷酸葡萄糖脫氫酶可催化G-6-P和NADP⁺生成6磷酸葡萄糖酸和NADPH,，在340nm處有吸收峰,，據(jù)此可以計算6-磷酸葡萄糖的含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀,、微量石英比色皿/96孔UV板、天平,、低溫離心機,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

組織：按照質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g,，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于沸水浴煮5min（用封口膜封口,，防止爆蓋）,，冷卻至室溫后于4℃ 12000g離心10min，取上清置冰上待測,。

二,、測定步驟

1、 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上,，調節(jié)波長至340nm,，分光光度計用蒸餾水調零。

2,、 工作液37℃預熱5min,。

3、 樣本測定（在96孔UV板/微量石英比色皿中加入下列試劑）

三,、6-磷酸葡萄糖含量計算公式

1. 按樣本蛋白濃度計算：

G6P含量（μmol/g prot）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V提取÷（Cpr×V提取）×F

=0.5×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr×F

2. 按樣本質量計算：

G6P含量（μmol/g 質量）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V提取÷W×F

=0.5×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F

C標準：標準點濃度,，0.5μmol/mL；V提?。杭尤胩崛∫旱捏w積,，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL,；W：樣本質量，g,；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1. 最好兩個人同時做此實驗,，一個人比色,，一個人計時，以保證實驗結果的準確性,。

2. 若樣本ΔA<0.01,，可適當增大樣本量后測定；若樣本ΔA>1.0或A測定>1.5,，可用蒸餾水稀釋上清液后測定,，

注意同步修改計算公式中的稀釋倍數(shù)。

實驗實例：

1,、 取0.102g大鼠肝臟加入提取液進行冰浴勻漿,，取上清后按照測定步驟操作，用96孔UV板測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）=（0.281-0.177）-（0.045-0.045）=0.104,，ΔA標準=（A2標準-A1標準）-（A2空白-A1空白）=（0.470-0.074）-（0.045-0.045）=0.396,，按樣本質量計算6-磷酸葡萄糖含量得：

G6P含量（μmol/g 質量）=0.5×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =1.287 μmol/g 質量。

2,、 取0.103g大鼠肺加入提取液進行冰浴勻漿,，取上清后按照測定步驟操作，用96孔UV板測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）=（0.179-0.113）-（0.045-0.045）=0.066,，ΔA標準=（A2標準-A1標準）-（A2空白-A1空白）=（0.470-0.074）-（0.045-0.045）=0.396,，按樣本質量計算6-磷酸葡萄糖含量得：

G6P含量（μmol/g 質量）=0.5×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =0.809 μmol/g 質量。

參考文獻：

[1] Belford J, Feinleib M R .The increase in glucose-6-phosphate content of the heart after the administration of inotropic catecholamines, calcium, and aminophylline[J].Biochemical Pharmacology, 1962, 11(11):987-994.

[2] Ashcroft S , Capito K , Hedeskov C .Time course studies of glucose-induced changes in glucose-6-phosphate and fructose-1, 6-diphosphate content of mouse and rat pancreatic islets[J].Diabetologia, 1973, 9(4):299-302.

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