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親和層析填料 苯甲脒-瓊脂糖凝膠 6B
貨號：S9390
規(guī)格 ：25ml /100ml

一,、簡介
    苯甲脒類物質(zhì)是絲氨酸蛋白酶的廣譜抑制劑，所以將這類物質(zhì)偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠6B上,，可以從各種來源的樣品中一步純化胰蛋白酶,、凝血酶、尿激酶,、激肽釋放酶,、前激肽釋放酶等絲氨酸蛋白酶。
   苯甲脒瓊脂糖凝膠由于應(yīng)用新的活化方法所以流速高,，非特異吸附少,，而且填料粒度均勻，所以分離效果好,，是純化絲氨酸蛋白酶類適合的填料,。
二、親和填料特性

三,、  適用范圍
    本一步從各種樣品中純化絲氨酸蛋白酶類物質(zhì),。
四、應(yīng)用實例
    實驗名稱：苯甲脒瓊脂糖凝膠 FF 分離尿激酶,。

實驗步驟：
   （1）苯甲脒瓊脂糖凝膠 FF 裝柱,，1.6×20m，柱床體積為 10ml
   （2）用緩沖液 1 平衡 2-5 個床體積,，流速為 2ml/min
   （3）取尿激酶粗品 200mg 溶解在 20ml 的緩沖液 1 中,，用 0.45μm 的濾膜過濾，上樣,，流速為 1ml/min
   （4）用緩沖液 1 再洗 2-5 個床體積,，流速為 2ml/min
   （5）后緩沖液 2 進行洗脫，流速為 2ml/min,，收集洗脫峰,，用 SDS-PAGE 純化后的效果。
   （6）用純水洗 5 個柱床體積,，然后分別用 100mM,，pH8.0Tris-HCl 緩沖液含 1M NaCl 和 100mM,pH4.0的醋酸緩沖液含 1M NaCl 交替洗滌 3 次， 再用純水洗 3 個柱床體積,， 然后再用 20%的乙醇流洗 3 個柱床體積,，流速為 2ml/min，柱子置于+4~8℃環(huán)境中保存,。
   （7）色譜圖見圖 1,，SDS-PAGE 結(jié)果見圖 2。 緩沖液組成：

緩沖液 1：100mM pH7.4 的 PBS 緩沖液,；緩沖液 2：100mM 醋酸緩沖液,，pH4.0。
也可以用這個填料特異去除各種融合蛋白酶切后的絲氨酸蛋白酶,，例如凝血酶以及胰蛋白酶類蛋白酶,。
    例如去除凝血酶上樣緩沖液為： 50mM pH7.4 的 PBS 緩沖液含 0.15M NaCl,洗脫緩沖液為： 50mM pH7.4 的 PBS緩沖液含 1M NaCl。

SDS-PAGE 流程：
   （1）BSA 法測量樣品蛋白濃度,；
   （2）根據(jù)測定樣品的蛋白濃度,，算出 5-10μg/孔所需的體積,；
   （3）向 1.5ml EP 管中加入含 5-10μg 蛋白的樣品溶液,，若體積小于 10μL，則加 20mM PBS pH7.4 補足 10μl,；若體積大于 10μl,，則要加入 1ml 無水乙醇，－20℃下濃縮 1h,；
   （4）取濃縮樣品 10000rpm 離心 15min,，除去上清，37℃烘箱 10min 去除殘余的乙醇；
   （5） 在樣品加入 20mM PBS pH7.4 和 2×loading buffer 各 10μl,， 100℃下 10min,。 取出后用冷卻 30s， 4000rpm離心 1s,；
   （6）點樣,，電泳。

五,、注意事項：
5.1 色譜柱裝填
   1,、所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體好做脫氣處理,。
   2,、在柱子下端加入蒸餾水，以除去柱子中的空氣,，關(guān)閉柱子出口,，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水。
   3,、將瓊脂糖凝膠連續(xù)倒入柱子時,，要用玻璃棒的緊靠柱子內(nèi)壁引流，以減少氣泡的產(chǎn)生,，讓填料先自然沉降,。
   4、柱壓不超過 0.3MPa,，如果裝柱系統(tǒng)中無法測柱壓,，則控制流速高于 300cm/h，但是在使用中一般只用大流速的 75%,。
   5.2 蛋白的結(jié)合
      平衡緩沖液可以采用如下配方：100mM pH7.4 的 PBS 緩沖液,，0.1M NaCl，pH8.0,。上樣完畢后,，繼續(xù)用平衡緩沖液洗柱子，直到基線平穩(wěn),。
   5.3 蛋白的洗脫
  （1）洗脫可以采取特異性或者非特異性洗脫,。
  （2）特異性洗脫可以用目標分子的競爭劑，對氨基苯甲脒的抑制劑,。對非特異性洗脫而言,，可以選用以下幾種方法：
      a 改變離子強度，通常加入 1M 的 NaCl,，必要的話可以采用階段洗脫或線性梯度洗脫,。
      b 改變 pH,，可采用階段洗脫洗脫或線性梯度洗脫來達到目的。
      c 降低洗脫緩沖液的極性,。如可以在洗脫緩沖液中加入 10%的二氧六環(huán)等,。
      d 使用變性劑。如在洗脫緩沖液中加入尿素,、鹽酸胍等,。

六、再生,、清洗
6.1  再生
    用純水洗5個柱床體積,，然后分別用100mM，pH8.0Tris-HCl緩沖液含1M NaCl和100mM,pH4.0的醋酸緩沖液含
    1M NaCl交替洗滌3次,，再用水洗3個柱床體積,，然后再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2ml/min,，柱子置于+4~8℃環(huán)境中,。
    如果在色譜操作過程中用到了變性劑或者去污劑，也可以用上述方法洗柱子,。
6.2  清洗
在應(yīng)用中,，柱子上結(jié)合的一些物質(zhì)如變性蛋白和脂質(zhì)等不能通過再生過程去除，這種情況下,，可以用去污劑如0.1%Triton X-100在37℃洗柱子1min,。之后立即用5個床體積的平衡液洗柱子。
七,、保存
在20%乙醇中,，4℃下長期保存。

親和層析填料 苯甲脒-瓊脂糖凝膠 6B訂購說明：

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運輸說明：

1,、極低溫產(chǎn)品：極低溫產(chǎn)品運輸過程中加裝干冰運輸,。用干冰把產(chǎn)品包裹起來，再用泡沫盒密封,，膠帶層層粘住泡沫盒,，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞,，安全快速高效放心的送客戶的手中,，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實驗保駕護航,。
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