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蛋白質(zhì)純化試劑 鎳-瓊脂糖凝膠 6FF（HIS 標(biāo)簽純化樹(shù)脂）
貨號(hào)：P2010
規(guī)格：5ml/ 10ml（凝膠體積）
保存 ：4°C 保存,，有效期少一年

產(chǎn)品說(shuō)明：
    Ni-NTA瓊脂糖凝膠 6FF是用于純化 6×His標(biāo)簽重組蛋白的一種純化介質(zhì),，它是由 6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的 6×His標(biāo)簽重組蛋白,。
    NTA,，含有四個(gè)螯合區(qū),，較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合Ni 2+ ,。6×His可與Ni 2+ 螯合,，從而使His標(biāo)簽蛋白結(jié)合在Ni-NTA純化介質(zhì)上，未結(jié)合的蛋白被洗滌下去,，結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過(guò)一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來(lái),，從而得到高純度的目的蛋白,。該純化介質(zhì)與His標(biāo)簽蛋白具有的親和力，可達(dá) 5-20 mg/ml,。
    可在非變性和變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)所得的His標(biāo)簽蛋白,。純化程序簡(jiǎn)單，所得的蛋白純度可高達(dá) 95％,。
    Ni-NTA可再生 4-6 次,，重復(fù)使用。本產(chǎn)品懸浮液為 20％乙醇,，已螯合Ni 2+ ,。

操作方法：
A.  非變性條件下抽提 His  標(biāo)簽蛋白
     1) 準(zhǔn)備細(xì)胞，接種,，誘導(dǎo)表達(dá),。收集細(xì)胞，置于-70°C 或立即進(jìn)行步驟 2 操作,。
     2) 加入 1/20 細(xì)胞生長(zhǎng)體積的 NTA-0 Buffer 和 PMSF,。PMSF 使用的工作濃度為 1 mM 現(xiàn)用現(xiàn)加。
     3) 將細(xì)胞懸浮起來(lái),，加入溶菌酶,，混勻，冰上放置 30 分鐘,，超聲或勻漿破碎細(xì)胞,。該步驟冰上操作。
     4) 加入 10% Triton X-100, 使終濃度為 0.05%,，充分混勻，冰上放置 15 分鐘,。
     5) 12000 rpm/min(20,000×g 以上),，4°C 離心 15 分鐘以上。取上清,，置于冰上備用或-20°C 保存,。
     6) 將 NTA 樹(shù)脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗,。
     7) 將樣品加 NTA 層析柱中,，流速在 15 ml/h 左右，收集穿透部分,，用 SDS/PAGE 分析蛋白的結(jié)合情況,。
     8) 層析用 5 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗，流速控制在 30 ml/h 左右,。
     9) 分別用 5 倍 NTA 體積的 NTA-20,、NTA-40,、NTA-60、NTA-80,、NTA-100,、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脫,，流速控制在 15 ml/h 左右,，收集洗脫液，每管收集一個(gè) NTA 體積,。
    10) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況,。 為有效的方式是 SDS-PAGE 分析。 也可以用 Bradford 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒,，快速確定蛋白質(zhì)的含量,，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的分布。
    11)純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定,。
NTA-0 ,、 20、 40,、 60,、 80、 100,、 200,、 1000Buffer 分別為濃度 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol，添加 0,、20,、40、60,、80,、100、200,、1000 mM Imidazole,。
B. 變性條件下從包涵體中純化 His  標(biāo)簽蛋白
    1) 準(zhǔn)備細(xì)胞，接種,，誘導(dǎo)表達(dá),。收集細(xì)胞，置于-70°C 或立即進(jìn)行步驟 2 操作,。
    2) 加入 1/20 細(xì)胞生長(zhǎng)體積的 GuNTA-0 Buffer 和 PMSF,。PMSF 使用的工作濃度為 1 mM 現(xiàn)用現(xiàn)加。
    3) 將細(xì)胞懸浮起來(lái),，冰上超聲破碎細(xì)胞,，降低粘稠度,。
    4) 室溫放置 30 分鐘，間或混勻或用磁力攪拌,。
    5) 12000 轉(zhuǎn)/分（20,000×g 以上）,，4°C 離心 15 分鐘以上。取上清,，置于冰上備用或-20°C 保存,。

    6) 將 NTA 樹(shù)脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的 GuNTA-0 Buffer 洗,。
    7) 將樣品加到 NTA 層析柱中,，流速控制在 15 ml/h 左右，收集穿透部分,，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況,。
    8) 層析用 5 倍 NTA 體積的 GuNTA-0 Buffer 洗，流速控制在 30 ml/h 左右,。
    9) 分別用 5 倍 NTA 體積 GuNTA-20,、GuNTA-40，GuNTA-60,、GuNTA-100,、GuNTA-500 洗脫，流速在15 ml/ h 左右,，收集洗脫液,，每管收集一個(gè) NTA 體積。
    10) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況,。 為有效的方式是 SDS/PAGE 分析,。 也可以用 Bradford 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量,，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的分布,。
   11) 目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。
   12) 純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)需要復(fù)性,，復(fù)性常用的手段可以參考有關(guān)手冊(cè)確定的原則。
GuNTA-0 ,、20,、40、60,、100,、500Buffer 分別為濃度 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M
Guanidium HCl 添加 0、20,、40,、60,、100、500 mM Imidazole,。
C. NTA  樹(shù)脂的再生
    NTA 樹(shù)脂在使用若干次數(shù)（3-5 次）后,，結(jié)合效率有所下降，可以用以下方法再生,，提高樹(shù)脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率,。NTA 樹(shù)脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計(jì)出 NTA 的樹(shù)脂體積,，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋铮?在等上一步再生溶液流干后,， 再加下一步再生溶解。 用戶需要自行準(zhǔn)備 25%,、 50%,、75%、100%（v/v）乙醇和去離子水,。
從層析柱下端流干所有溶液,，用 2 倍 NTA 樹(shù)脂體積的 Stripping Solution I、2 倍體積的去離子水,、3 倍體積的 Stripping Solution II,、1 倍體積的 25%乙醇、1 倍體積的 50%乙醇,、1 倍體積的 75%乙醇,、5 倍體積的 100%乙醇、 1 倍體積的 75%乙醇,、 1 倍體積的 50%乙醇,、 1 倍體積的 25%乙醇、 1 倍體積的去離子水,、 5 倍體積的 StrippingSolution III,、3 倍體積的去離子水分別洗一遍。
如果立即使用,， 用 5 倍體積的 Ni Charging Solution 洗,， 再用 10 倍體積的平衡溶液 （NTA-0Buffer 或 GuNTA-0Buffer）洗；如果想長(zhǎng)期儲(chǔ)存,，加入 1 倍體積的 20%乙醇,，4°C 保存，使用前用 5 倍體積的 Ni Charging Solution洗,，再用 10 倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer 或 GuNTA-0 Buffer）洗再生溶液配方：Stripping Solution I: 6M GuHCl, 0.2M acetic acid,。Stripping Solution II: 2% SDS。
Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0,。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

相關(guān)產(chǎn)品：

P1020 1×PBS ,， PH7.2-7.4 ,， 0.01M ，
T1150  1M Tris-HCl(PH=8.0)
P1300  SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒
PR1600 預(yù)染低分子量蛋白 MARKER
PC0020 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒
P0100  PMSF(100mM)
L1080  溶菌酶（ 100mg/ml ）
I1020  IPTG  溶液 (50mg/ml)

蛋白質(zhì)純化試劑 鎳-瓊脂糖凝膠 6FF（HIS 標(biāo)簽純化樹(shù)脂）訂購(gòu)說(shuō)明：

1,、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨,，一般情況下都能訂貨當(dāng)日發(fā)貨。 
2,、部分非常用產(chǎn)品,，需提前1－2日預(yù)訂，海外期貨則需要提前3-6周預(yù)訂,。 
3,、部分產(chǎn)品價(jià)格會(huì)因貨期、批次等因素發(fā)生變化,，若有變動(dòng)以訂貨當(dāng)日新價(jià)格為準(zhǔn),。 
4、每日訂單截止時(shí)間為16點(diǎn)整,，部分城市可到17點(diǎn)整,，因超過(guò)截止時(shí)間造成當(dāng)日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
5,、請(qǐng)辦理完貨款后,，將收據(jù)、底單等連同收貨人的地址,、姓名,、等以傳真、,、短信,、等形式通知我們。

運(yùn)輸說(shuō)明：

1,、極低溫產(chǎn)品：極低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中加裝干冰運(yùn)輸,。用干冰把產(chǎn)品包裹起來(lái)，再用泡沫盒密封,，膠帶層層粘住泡沫盒,，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞,，安全快速高效放心的送客戶的手中,，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航,。
2,、低溫產(chǎn)品：低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中加裝索萊寶冰袋運(yùn)輸,。事先用冰袋把產(chǎn)品包裹起來(lái),，再使用泡沫盒密封,，用膠帶嚴(yán)實(shí)密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續(xù)一周）,，然后交付給合作快遞,，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一,，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航,。
3、常溫產(chǎn)品：常溫產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中無(wú)需加冰或者特殊包裝,。產(chǎn)品由公司庫(kù)房人員快速配貨,，準(zhǔn)確快速高效的快遞保證產(chǎn)品快速送達(dá)您的手中。