ELISA的操作要點：
的試劑,，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件,。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內醫(yī)學檢驗一般均用板式點,。
一,、標本的采取和保存
可用作ELISA測定的標本十分廣泛,，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液,、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份,。有些標本可直接進行測定（如血清、尿液）,，有些則需經預處理（如糞便和某些分泌物）,。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,，其他成份均同等于血清,。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固,、血塊收縮后即可取得,。除特殊情況外，在醫(yī)學檢驗中均以血清作為檢測標本,。在ELISA中血漿和血清可同等應用,。血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血,，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色,。
血清標本宜在新鮮時檢測,。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP,，也會產生假陽性反應,。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深,。一般說來，在5天內測定的血清標本可放置于4℃,，超過一周測定的需低溫冰存,。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮,，分布不均,，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡,，可上下顛倒混和,，不要在混勻器上強烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過濾,，澄清后再檢測,。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測,，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑,。
二,、試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的,，應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正,。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用,。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
三,、加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚,，即加標本，加酶結合物,，加底物,。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出,，不可產生氣泡。加標本一般用微量加樣器,，按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染,，也可用一次性的定量塑料管加樣,。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本,，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和,。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成,。
四,、保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后,?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間,，這一保溫過程稱為溫育，有人稱之為孵育,，在ELISA中似不恰當,。
ELISA屬固相免疫測定，抗原,、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會,，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,，因此需經擴散才能達到反應的終點,。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育,。
溫育常采用的溫度有43℃,、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等,。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時,，實驗表明,，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達,。為加速反應,，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行,，但不宜采用更高的溫度,。抗原抗體反應4℃更為*,，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜,，以形成多的沉淀。但因所需時間太長,，在ELISA中一般不予采用,。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴,，可將ELISA板置于水浴箱中,，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡,。為避免蒸發(fā),，板上應加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上,。若用保溫箱,，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底墊濕的紗布,，后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時候更應如此,。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內,，標準室溫溫度是指20-25℃,，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時,，ELISA板只要平置于操作臺上,。
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