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ELISA法檢測(cè)干擾素的說(shuō)明書(shū)

閱讀:1927      發(fā)布時(shí)間:2012-8-21
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干擾素(IFN)是一類(lèi)具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì),僅在同種細(xì)胞上發(fā)揮作用,。根據(jù)其來(lái)源,、理化及生物學(xué)性質(zhì)的不同,可分為IFN-α,、IFN-β,、IFN-γ3種干擾素。其中,,IFN-α主要由白細(xì)胞產(chǎn)生,,IFN-β由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生,IFN-γ主要由T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中受到抗原或絲裂原活化后分泌產(chǎn)生,。3種干擾素中,,IFN-α、IFN-β抗病毒作用較強(qiáng),,IFN-丁免疫調(diào)節(jié)作用較強(qiáng),。目前已可用基因重組技術(shù)制備干擾素投入臨床使用。

干擾素不能直接滅活病毒,,其抗病毒作用是由于它能激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白基因,,制造抗病毒蛋白,抑制病毒在體內(nèi)復(fù)制,。干擾素不僅可抑制已感染細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制,,而且還可使未感染細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài),對(duì)中斷病毒的細(xì)胞間傳播有一定作用,;但對(duì)病毒整合基因可能僅有暫時(shí)抑制其mRNA的轉(zhuǎn)錄作用,,不能清除病毒基因。干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為它是重要的巨噬細(xì)胞活化因子(macro-phageactivating factor,,MAF),,活化的巨噬細(xì)胞能殺死病原微生物或殺傷腫瘤細(xì)胞,。干擾素能增強(qiáng)各種細(xì)胞表達(dá)MAF分子從而有利于遞呈抗原或利于T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別和殺傷;還能促進(jìn)T,、B細(xì)胞的分化,,活化NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,從而有助于加強(qiáng)免疫應(yīng)答,。由于干擾素不是一種淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)因子,,故常抑制淋巴細(xì)胞(特別是B細(xì)胞)的增殖。
[檢測(cè)方法] ELISA法
[方法學(xué)原理] 抗人IFN抗體包被在微孔反應(yīng)板上,,待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IFN會(huì)與抗人IFN抗體結(jié)合,,游離的成分被洗去,同時(shí)加入生物素化的抗人IFN抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素,。生物素與親和素特異結(jié)合,,抗人IFN抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人IFN結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,游離的成分被洗去,。加入顯色劑,,若反應(yīng)孔中有IFN,HRP會(huì)使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色,,加終止液變黃色,。在波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光度,IFN濃度與吸光度成正比,,可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的IFN濃度,。
[儀器] 酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。
[檢測(cè)步驟]
1.在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測(cè)樣本,、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul,,再加生物素化抗體工作液50ul。
2.振蕩混勻,,置20~25℃環(huán)境中溫育120min,。
3.將孔內(nèi)液體吸干,用洗滌液充分洗滌5次,,干燥,。
4.除空白孔外,加入酶結(jié)合物工作液100u1,。
5.振蕩混勻,,置20~25℃環(huán)境中溫育30min。
6.將孔內(nèi)液體吸干,,用洗滌液充分洗滌5次,,干燥。
7.每孔加入顯色劑A、B各50ul,,輕輕振蕩混勻,,37℃環(huán)境中避光顯色10min。
8.加入終止液50gl后,,輕輕振蕩混勻,。用酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng))測(cè)定各孔吸光度,與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照,,求出IFN值,。
[正常參考值] 各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢測(cè)方法的不同確立正常參考值。
[注意事項(xiàng)]
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用,,來(lái)用完的微孔條用自封袋密封保存,。
2.酶標(biāo)板洗滌時(shí)各孔均需加滿(mǎn)洗滌液,防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈,。應(yīng)設(shè)定30-60s的洗滌浸泡時(shí)間,。
3。滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次,,使液體混勻,。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直,以使滴量準(zhǔn)確,。
4.所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol/L硫酸,,使用時(shí)應(yīng)注意安全
5.每批樣本應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。
6.檢測(cè)劑工作液按說(shuō)明書(shū)臨用前配置。
7.若標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍以外,,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè),。
[臨床意義] IFN水平的改變主要見(jiàn)于自身免疫性疾病,;在感染性疾病中,,升高見(jiàn)于急性病毒感染,降低見(jiàn)于乙型肝炎病毒攜帶者,、其他慢性病毒性肝炎及AIDS患者,。

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