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大鼠（Rat）NF-k Bp65 使用說(shuō)明書(shū)

閱讀：2756 發(fā)布時(shí)間：2010-11-22

本試劑僅供研究使用

試驗(yàn)原理：

NF-k Bp65 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知NF-k Bp65 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),。先將NF-k Bp65 和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,，加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP,。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,，然后加入底物A,、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用,。產(chǎn)生顏色,。顏色的深淺和樣品中NF-k Bp65 的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制：

試劑盒成份	96孔配置	48孔配置
96/48人份酶標(biāo)板	1塊板（96T）	半塊板（48T）
塑料膜板蓋	1塊	半塊
標(biāo)準(zhǔn)品：200ng/ml	1瓶（1.0ml）	1瓶（0.5ml）
空白對(duì)照	1瓶（1.0ml）	1瓶（0.5ml）
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液	1瓶（8.0ml）	1瓶（4.0ml）
生物素標(biāo)記的抗NF-k Bp65 抗體	1瓶（8.0ml）	1瓶（4.0ml）
親和鏈酶素-HRP	1瓶（12ml）	1瓶（5ml）
洗滌緩沖液	1瓶（20ml）	1瓶（10ml）
底物A	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）
底物B	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）
終止液	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）

自備材料：

1. 蒸餾水,。

2. 加樣器：5ul,、10ul、50ul,、100ul,、200ul、500ul,、1000ul,。

3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

樣品收集,、處理及保存方法：

1,、血清……操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原

和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后,，1000×g離心10分鐘將血紅

細(xì)胞迅速小心地分離。

2,、血漿……EDTA,、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè),。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。

3、細(xì)胞上清液……1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4,、組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,，取上清液,。

5,、保存……如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存,，避免反復(fù)冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

操作注意事項(xiàng)：

● 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存,，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,，不可保存,。

● 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存,，以免變質(zhì),。

● 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用,。

● 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A,、B液時(shí),，避免使用帶金屬部分的加樣器。

● 使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。

● 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開(kāi)蓋子,。底物B對(duì)光敏感,，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,，有毒,。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

● 加入試劑的順序應(yīng)一致,，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣,。

● 按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間,、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作,。

安全性：

1. 避免直接接觸終止液和底物A、B,，一旦接觸到這些液體,，請(qǐng)盡快用水沖洗,。

2. 實(shí)難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品,。

3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。

試劑的準(zhǔn)備：

1. 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋?xiě)?yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備，不能儲(chǔ)存,。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻,。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

200 ng/ml	（6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	原倍濃度不用稀釋直接加入50ul
100 ng/ml	（5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50 ng/ml	（4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25 ng/ml	（3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
12.5 ng/ml	（2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
6.25 ng/ml	（1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 ng/ml	（空白對(duì)照）	原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

2. 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

試劑盒性能：

1. 靈敏度：小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品,。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng),。

3. 重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于10%。

操作步驟：

1. 使用前,，將所有試劑充分混勻,。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡,，產(chǎn)生加樣上的誤差,。

2. 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定,，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔,、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育45分鐘。

4. 甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次,。

5. 每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育30分鐘,。

6. 甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作4次,。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。

7. 每孔加入底物A,、B各50ul，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育5分鐘,。避免光照。

8. 取出酶標(biāo)板,，迅速加入50ul終止液,，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。

9. 在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值,。

結(jié) 果判斷與分析：

1,、儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y）,，相應(yīng)的NF-k Bp65 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X）,，做得相應(yīng)的曲線，樣品的NF-k Bp65 含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。

3,、檢測(cè)值范圍： 0-200ng/ml

4、敏感度：0.1ng/ml

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