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人(Human) 酸性神經(jīng)鞘磷脂酶檢測說明書

閱讀:1945      發(fā)布時間:2010-11-17
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本試劑僅供研究使用 
試驗原理
   ASM試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)名疫吸附實驗(ELISA),。已知ASM濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進行檢測。先將ASM和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育,。洗滌后,,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,,然后加入底物A,、B,和酶結(jié)合物同時作用,。產(chǎn)生顏色,。顏色的深淺和樣品中ASM的濃度呈比例關(guān)系。
 
試劑盒內(nèi)容及其配制                                 

試劑盒成份(2-8℃保存)
96孔配置
48孔配置
配制
96/48人份酶標(biāo)板
1塊板(96T)
半塊板(48T)
即用型
塑料膜板蓋
1塊
半塊
即用型
標(biāo)準(zhǔn)品:200ng/ml       
1瓶(0.6ml)
1瓶(0.3ml)
按說明書進行稀釋
空白對照
1瓶(1ml)
1瓶(0.5ml)
即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液
1瓶(5ml)
1瓶(2.5ml)
即用型
生物素標(biāo)記的抗ASM抗體
1瓶(6ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
親和鏈酶素-HRP
1瓶(10ml)
1瓶(5ml)
即用型
洗滌緩沖液
1瓶(20ml)
1瓶(10ml)
按說明書進行稀釋
底物A
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
底物B
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
終止液
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
標(biāo)本稀釋液
1瓶(12ml)
1瓶(6.0ml)
即用型

 
自備材料
1. 蒸餾水
2. 加樣器:5ul,、10ul,、50ul、100ul,、200ul,、500ul、1000ul
3. 振蕩器及磁力攪拌器等,。
 
安全性
1. 避免直接接觸終止液和底物A,、B。一旦接觸到這些液體,,請盡快用水沖洗,。
2. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品,。
3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。
 
操作注意事項
1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,使用前恢復(fù)到室溫,。稀釋過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,,不可保存。
2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,,密封保存,,以免變質(zhì)。
3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用。
4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,,吸取終止液和底物A,、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器,。
5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6. 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干,,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水,。
7. 底物A應(yīng)揮發(fā),,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,,避免長時間暴露于光下,。避免用手接觸,     有毒,。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值,。
8. 加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣,。
9. 按照說明書中標(biāo)明的時間,、加液的量及順序進行溫育操作。
樣品收集,、處理及保存方法
1,、 血清……操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后,,1000×g    離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2,、 血漿……EDTA,、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測,。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。
3、 細胞上清液……1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。
4,、 組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,,取上清液,。
5、 保存……如果樣品不立即使用,,應(yīng)將其分成小部分-70℃保存,,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中大量顆粒,,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。
試劑的準(zhǔn)備
1. 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備,不能儲存,。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻,。稀釋比例按下表中進行:

200ng/ml
(6號標(biāo)準(zhǔn)品)
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul
100ng/ml
(5號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50ng/ml
(4號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25ng/ml
(3號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
12.5ng/ml
(2號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
6.25ng/ml
(1號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0ng/ml
(空白對照)
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

 
2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍釋。
操作步驟
1. 使用前,,將所有試劑充分混勻,。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,,產(chǎn)生加樣上的誤差,。
2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。 標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1:1 稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。
3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔,、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體,。蓋上膜板,,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時,。
4. 甩去孔內(nèi)液體,,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,,甩去洗滌液,,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次,。如果用洗板機洗滌,,洗滌次數(shù)增加一次。
5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,,輕輕振蕩混勻,,37℃溫育30分鐘。
6.  甩去孔內(nèi)液體,,每孔加滿洗滌液,,振蕩30秒,甩去洗滌液,,用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,,洗滌次數(shù)增加一次,。
7. 每孔加入底物A、B各50ul,,輕輕振蕩混勻,,37℃溫育10分鐘,。避免光照。
8. 取出酶標(biāo)板,,迅速加50ul終止液,,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9. 450nm波長處測定各孔的OD值,。
 
建議使用的實驗方案

計算單位
標(biāo)準(zhǔn)品濃度
(ng/ml)
 
A
200
200
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
B
100
100
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
C
50
50
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
D
25
25
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
E
12.5
12.5
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
F
6.25
6.25
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
G
0
0
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
H
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品

 
試劑盒性能
1. 靈敏度:小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品,,稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990,。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應(yīng),。
3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%,。
 
局限
6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。
 
免責(zé)聲明:
1,、本產(chǎn)品僅供研究使用,,不得用于臨床實驗或人體實驗,否則所產(chǎn)生的一切后果,,本公司概不承擔(dān),。
 
結(jié) 果 判 斷 與 分 析
1、儀器值:于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2,、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),,相應(yīng)的P-selectin標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,,樣品的P-selectin含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度,,再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,,將樣品的OD值代入方程式,,計算出樣品濃度,在乘以稀釋倍數(shù),,即為樣品的實際濃度,。
3、檢測值范圍: 0-200ng/ml
4,、敏感度: 0.1ng/ml

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