蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法：測(cè)定食物中的蛋白質(zhì)含量有二種方法，一是凱氏微量法,，二是自動(dòng)定氮分析法。
一．凱氏微量法（蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法）
有手工滴定定氮和自動(dòng)定氮儀定氮,，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)經(jīng)濟(jì)條件設(shè)備而定,。
1.原理
蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解,，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨,。然后堿化蒸餾使氨游離，用過(guò)量硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù),，即為蛋白質(zhì)含量。
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
（NH4）2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4
2.方法
本法參照GB 5009.5 -85
適用于各類(lèi)食品及飼料中蛋白質(zhì)的測(cè)定
3.試劑
所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制,。試劑均為分析純,。
3.1硫酸銅
3.2硫酸鉀
3.3濃硫酸
3.4 2%硼酸溶液（或1%的硼酸）
3.5混合指示劑：1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶與1份0.1%次甲基藍(lán)乙醇溶液臨用時(shí)混合,。
3.6飽和氫氧化鈉：500g氫氧化鈉加入500ml水中,，攪拌溶解，冷卻后放置數(shù)日,，澄清后使用,。
3.7 0.01mol/L或0.05mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：需標(biāo)定后使用（配制及標(biāo)定方法見(jiàn)附錄）
4.儀器
消化爐 凱氏定氮蒸餾裝置 萬(wàn)分之一電子天平
凱氏定氮蒸餾裝置：如圖所示
5. 操作步驟
5.1樣品處理：精密稱(chēng)取0.1~2.0g固體樣品或2~5g半固體樣品或吸取液體樣品5~20ml，放入100ml或500ml凱氏燒瓶中,，加入0.2g硫酸銅,，0.3g硫酸鉀及3~20ml濃硫酸，放置過(guò)夜后小心加熱,，待內(nèi)容物全部炭化,，泡沫*停止后，加強(qiáng)火力,，并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸,，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，取下放冷后用約2～10ml蒸餾水沖洗瓶壁,，混勻后繼續(xù)加熱至液體呈藍(lán)綠透明,，取下放冷，小心加10~20ml水混勻,，放冷后,，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶,，洗液并入容量瓶中,，再加水至刻度，混勻備用,。取與處理樣品相同量的硫酸銅,、硫酸鉀、硫酸按同一方法做試劑空白實(shí)驗(yàn),。
5.2按圖裝好定氮裝置,，于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至約2/3處，加甲基紅指示液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性,，加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸,，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。
5.3向接收瓶?jī)?nèi)加入10ml,1~2%硼酸溶液及混合指示液1滴,，并使冷凝管的下端插入液面下,，吸取10ml樣品消化稀釋液由小玻璃杯流入反應(yīng)室，并以10ml水洗滌小燒杯使之流入反應(yīng)室內(nèi),，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞,。將3~10ml飽和氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯中，提起玻璃塞使其緩緩流入反應(yīng)室,，立即將玻璃塞蓋緊,，并加水于小玻璃杯中以防漏氣。加緊螺旋夾,，開(kāi)始蒸餾,。蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過(guò)冷凝管而進(jìn)入接收瓶?jī)?nèi)，蒸餾2min,，移動(dòng)接收瓶,，使冷凝管下端離開(kāi)液面，然后用少量中性水沖洗冷凝管下端外部,，再蒸餾1min取下接收瓶,，以0.01或0.05mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰色或藍(lán)紫色為終點(diǎn)。
同時(shí)吸取10ml試劑空白消化液按5.3操作,。
6. 計(jì)算
X = （V-V0 ）×C× 0.014× B/m ×100× F
式中：
X 一 樣品中蛋白質(zhì)含量,，g／100g；
V 一 樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積,，ml;
V0 - 空白消化液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積,，ml;
C 一 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液摩爾濃度,mol/L;
0. 014一 1mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液1 ml相當(dāng)?shù)藬?shù).
B 一 定容體積/取液量
m 一 樣品的質(zhì)量，g;
F 一 氮換算為蛋白質(zhì)計(jì)算因子,。蛋白質(zhì)的氮素含量不同,，故換算因子不同。詳見(jiàn)下表,。
蛋白質(zhì)計(jì)算因子
食 物 計(jì)算因子
蛋,，魚(yú),，肉及制品,，禽類(lèi)，玉米,，高粱,，豆類(lèi)，水果和蔬菜類(lèi) 6.25
乳及乳制品 6.38
大米 5.95
小麥面 普通粉 5.70
全麥，大麥,，燕麥,，裸麥,小米，小麥面全麥 5.83
小麥 5.80
黃豆 5.71
花生 5.46
芝麻,，向日葵 ,，核桃和榛子 5.30
麩皮 6.31
7. 舉例
設(shè)取樣品0.1000g，消化后稀釋至100 ml; ,。取10 ml樣品稀釋液,，標(biāo)準(zhǔn)鹽酸為0.01 mol/L ，空白滴定為0.12ml; ,，樣品滴定用去的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸為3.21 ml; ,，測(cè)得樣品中蛋白質(zhì)百分率為：
（3.21-0.12）×0.01×0.014×10／0.01× 100× 6.25
＝（3.21-0.12）×8.75＝27.0%
8. 附錄：
（1）標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液（0.1 mol/L HCl）配制及標(biāo)定：
配制：量取9毫升HCl，加適量水稀釋至1000毫升,。
標(biāo)定：稱(chēng)取約0.15克左右在270～300℃干燥至恒重的基準(zhǔn)無(wú)水碳酸鈉,，加50毫升水使之溶解，加10滴溴甲酚綠-甲基紅混合指示液,，（量取30ml0.2%溴甲酚綠乙醇溶液,，加入20ml0.1%甲基紅乙醇溶液，混勻）用配制的鹽酸滴定至溶液由綠色變紫紅色,，煮沸2min,，冷卻至室溫，繼續(xù)滴定至溶液由綠色變?yōu)榘底仙?。同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn),。
（2）計(jì)算：
C = m
（v-v0）×0.0530
C - HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的實(shí)際濃度,mol/L
m - 基準(zhǔn)無(wú)水碳酸鈉的質(zhì)量,g;
v - HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液用量,ml;
vo - 試劑空白HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液用量,ml;
0.0530-1.00 ml HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液〔C（HCl）=1mol/L〕相當(dāng)基準(zhǔn)無(wú)水碳鈉g。
0. 01mol/L HCl：吸取標(biāo)定過(guò)的0.1mol/L HCl 10 ml,，準(zhǔn)確稀釋至100毫升,。必要時(shí)重新標(biāo)定濃度。
9.注意事項(xiàng):
9.1干樣用稱(chēng)量紙稱(chēng)重連紙一同消化,，空白管同樣放稱(chēng)量紙消化,。
9.2 含糖量高和油脂高的樣品消化時(shí)容易溢出，加熱要緩慢,。
9.3 稀釋樣品時(shí)消化液過(guò)熱,，加水反應(yīng)猛烈使樣品損失；消化液 過(guò)冷,，加水后鹽析不溶解,。
二、自動(dòng)定氮分析法（蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法）
1.原理
本方法為凱氏微量定氮法,，將蛋白質(zhì)的氮素轉(zhuǎn)化成氨,，與硫酸化合成硫酸銨,，然后測(cè)定氨量。由此計(jì)算出氮素含量,，再乘以相應(yīng)的系數(shù)即為蛋白質(zhì)含量,。化學(xué)反應(yīng)式如下：
2NH2（CH2）2COOH+13 H2SO4→（NH4）2 SO4+6CO2+12 SO2+16H2O
（NH4）2 SO4+2NaOH→2 NH3+2H2O + Na2SO4
2.方法來(lái)源
GB/T 6432-94 本法適用于各種食物和飼料的測(cè)定
3.儀器
KJELTEC AUTO 1030 ANALYZER（瑞典特卡托公司） 40孔消化爐
4.試劑
本實(shí)驗(yàn)所用試劑皆為分析純,，所用水皆為蒸餾水
（1）濃硫酸 98% H2SO4
（2）凱氏片 （催化劑）K2SO4 + Se
（3）40%氫氧化鈉溶液（NaOH） W/V
（4）無(wú)水硫酸鈉 Na2SO4
（5）1%硼酸（H3BO4）吸收液稱(chēng)取100g硼酸溶于10L水中,。加入100ml溴鉀酚綠溶液，再加入70ml甲基紅溶液,，zui后加入3ml 4%氫氧化鈉溶液,。
（6）0.1mol/L鹽酸（HCL）標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)定后使用,。
5.操作步驟
5.1樣品消化：稱(chēng)取一定量的樣品于消化管中（半固體樣品用稱(chēng)量紙稱(chēng)?。右涣P氏片于消化管中,，然后加入5ml濃硫酸,，放置過(guò)夜，同時(shí)做樣品空白管,。在消化過(guò)程中,，先用低溫消化（防止高溫消化時(shí)樣品溢出），低溫消化1小時(shí)后,，將溫度升到zui,，至消化液無(wú)色透明。待消化液冷卻后,，加入少量水沖洗消化管內(nèi)壁,，振搖，以免內(nèi)壁粘有樣品以致消化不*,。然后于消化爐上再消化,，直至液體無(wú)色透明。放置室溫后,，加水至25ml,，待測(cè)。
5.2樣品定氮：開(kāi)啟1030自動(dòng)分析儀電源,，輸入測(cè)定時(shí)的參數(shù),，打開(kāi)STEAM按鈕，產(chǎn)生蒸氣5分鐘,，同時(shí)調(diào)節(jié)蒸氣表,，使蒸氣表的指針指到NORMAL。zui后將消化管裝入,，關(guān)閉安全門(mén),，開(kāi)始自動(dòng)定氮。當(dāng)CYCLEOVER燈亮?xí)r,，記錄滴定結(jié)果,，打開(kāi)安全門(mén)，進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定,。
6.計(jì)算
蛋白質(zhì)（g/100g）= （V-V0）×0.01401×N×f/m×100
V：樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積,，ml；
V0：試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積,， ml,；
N：鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度， mol,；
0.01401：1mol鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml相當(dāng)于氮克數(shù)
f： 氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)（一般樣品的系數(shù)為6.25）,；
m：樣品的質(zhì)量，g,；
7.注意事項(xiàng)
7.1 對(duì)含糖高的樣品或油脂樣品在消化過(guò)程中必須先低溫消化,，防止樣品溢出，消化所需時(shí)間較長(zhǎng),。
7.2 樣品的稱(chēng)樣量不宜過(guò)多,，否則試劑消耗多，消化時(shí)間長(zhǎng),，適宜稱(chēng)樣范圍在0.05～2.00g之間,。
7.3 消化液過(guò)冷，在加水時(shí),，消化液有鹽析出,。將消化管放在消化爐上加熱，使沉淀溶解,。
7.4 使用自動(dòng)分析儀時(shí),，定氮前，應(yīng)將管路中的吸收液排出去,，因?yàn)楣苈分械奈找洪L(zhǎng)時(shí)間停留會(huì)變色,。
7.5 在產(chǎn)生蒸氣的水中加入無(wú)水硫酸鈉是為了提高水中的電解質(zhì)。
7.6 本儀器消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量*范圍在0.5～7ml,。
紫外檢測(cè)儀,、核酸蛋白檢測(cè)儀