（一）試劑PCR儀
　?。?）引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測(cè)的DNA不同,，選用不同引物,，每種病原微生
　　物都有自己特異的引物。
　?。?）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來(lái)的,，能耐受高溫90℃-100℃。
　?。?）10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠,。10×PCR緩沖液隨酶一起購(gòu)買。
　?。?）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP,、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并,，加入滅菌去離子水溶解,，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl,，-20℃保存,。dNTP濃度用UV吸收法測(cè)定?，F(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。
　?。?）DNA模板：用處理液將待測(cè)標(biāo)本處理,，不同處理方法、操作各異,，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測(cè)的DNA,。
　　（二）操作程序PCR儀
　　過(guò)去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR儀必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中,，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增,。具體如下：
　　（1）向一微量離心管中依次加入
　　DNA模板　　　　　　 102-105拷貝
　　引物　　　　　　　　　 各1μmol/L
　　dNTP　 　　　　　 各200μmol/L
　　10×PCR緩沖液　　1/10體積
　　ddH2O　　　　　補(bǔ)到終體積（終體積50μl-100μl）
　　混勻后,，離心15s使反應(yīng)成分集于管底,。以上步驟僅在實(shí)驗(yàn)研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP,、10×PCR緩沖液,，引物，ddH2O混合在一起,，反應(yīng)體積為20-25μl,，只要試驗(yàn)人員加入處理好的樣品就可以了。
　?。?）加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā),。置反應(yīng)管于97℃變性10min。
　?。?）冷至延伸溫度時(shí)，加入1-5u Taq DNA聚合酶,，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合?，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。
　?。?）PCR儀的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃變性30s,，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s,，共循環(huán)30-35次,。zui后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min,，以確保充分延伸,。
　　PCR儀尚可用于組織標(biāo)本DNA的擴(kuò)增。由于固定組織標(biāo)本的DNA常發(fā)生降解,，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來(lái)一定困難,。87年Impraim等人首先將PCR技術(shù)引入固定包埋組織內(nèi)DNA分析,。他們先從組織標(biāo)本中提取DNA，再用PCR進(jìn)行特異性的DNA擴(kuò)增,，應(yīng)用這種方法,，他們成功地從保存30至40年之久的組織標(biāo)本DNA中擴(kuò)增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA,，操作比較繁瑣,。1988年Shibata等人對(duì)Impraim的方法進(jìn)行了改進(jìn)。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚,，0.4cm大小的切片,。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內(nèi)。加入400μl二甲苯脫脂,，離心除去二甲苯,，用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇,、加入100μlPCR反應(yīng)基質(zhì),，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增,。
　　在應(yīng)用PCR方法檢測(cè)RNA病毒時(shí),，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增，因?yàn)镻CR只能對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR,，簡(jiǎn)稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過(guò)程叫做反轉(zhuǎn)錄,，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成,。

文章關(guān)鍵詞：PCR儀