層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體,，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管,。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大,，可加大柱的直徑,，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米,，但在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上,。此外， 直徑加大,，洗脫液體體積增大,，樣品稀釋度大。
關(guān)于層析柱分離冬凌草甲素的操作方法介紹：
1 吸附劑的處理及柱子裝填
將一定量薄層層析硅膠裝人搪瓷盤置于烘箱中,，于105,。C活化2H后，取出放置室溫即可裝柱,。柱子采用干法填充,，填滿整個(gè)柱體,，不留死體積，密封后用柱塞式計(jì)量溶劑泵按丙酮一石油醚(5：95)比例泵人溶劑,，至溶劑流出止,。
2 上樣
將冬凌草的乙醇提取物400G用適量丙酮溶解，泵人中壓柱柱頭,，然后泵人石油醚1000RID,。
3 洗脫
以一定比例的石油醚一丙酮為洗脫液，60ML/MIN的流速進(jìn)行梯度洗脫,，柱的使用壓力為2～ 3KG/C ,。按每份500ML收集，TLC檢識(shí)展開劑丙酮一氯仿(2：8),，顯色劑5%香草醛濃硫酸乙醇液
至洗脫*,，相同流份合并，回收溶劑,。將冬凌草甲素流份合并蒸干,。加人適量甲醇熱溶后自然放置，析出結(jié)晶,，為冬凌草甲素,。
4 層析柱再生、平衡
有效成分經(jīng)TLC檢識(shí)全部流出后,，用純丙酮5000ML再生,，丙酮一石油醚(5：95)平衡后，可再次上樣,，反復(fù)使用(使用次數(shù)隨原料不同而異,，一般可連續(xù)使用2—6個(gè)月以上)。
5 重結(jié)晶
冬凌草甲素結(jié)晶析出*后,，減壓過濾,，然后用少量甲醇洗滌(洗滌液保留，作下次熱溶冬凌草甲素用),。將冬凌草甲素再用適量甲醇熱溶后放置,，結(jié)晶再次析出，待結(jié)晶*后,，抽濾,，用少量乙醚洗滌，將結(jié)晶室溫下晾干后置真空干燥箱中,，35度真空干燥至恒重,。密封于瓶中,，置干燥器中保存,。
6 薄層層析分析
取適量冬凌草甲素對(duì)照品及由上述方法得到的冬凌草甲素樣品甲醇溶解后點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿一丙酮(8：2)為展開劑進(jìn)行展開，5% 香草醛濃硫酸乙醇液顯色,，于105,。C烘至斑點(diǎn)清晰。表明在該展開系統(tǒng)下,，冬凌草甲素樣品和對(duì)照品都具有相同的RF值,，并呈現(xiàn)出同樣的藍(lán)綠色斑點(diǎn)，在制備的冬凌草甲素樣品中,，沒有雜質(zhì)斑痕,。
層析柱的分級(jí)分離時(shí)柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米,，10×25厘米,。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大,，被分離組分之間重新混合的可能性就大,，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象,，降低分辯力,。在分離時(shí)，死體積不能超過總床體積的1/1000,。分離度取決于柱高,，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度,，分離度與柱高的平方根相關(guān),，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米,。分族分離時(shí)用短柱,，一般凝膠柱長(zhǎng)20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1,，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍,。
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