凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個(gè)顆粒猶如一個(gè)篩子,。當(dāng)樣品溶液通過(guò)凝膠柱時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的空隙,，隨著溶劑流動(dòng),，因此流程較短，向前移動(dòng)速度快而首先流出層析柱,；反之,，相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔,，可自由地進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔,，在向下移動(dòng)過(guò)程中,，它們從凝膠內(nèi)擴(kuò)散到膠粒孔隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒,，如此不斷地進(jìn)入與逸出,，使流量增長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢而后流出層析柱,。而中等大小的分子,，它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布,，部分進(jìn)入顆粒，從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫,。這樣,，經(jīng)過(guò)層析柱，使混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離,。
對(duì)生物樣品來(lái)說(shuō),，經(jīng)常遇到的是兩種分離形式,。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開(kāi)，如蛋白質(zhì)與鹽類,，稱作類分離或組分離,。另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白,，這叫做分級(jí)分離,。后者對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作要求都比較高,。
1）類分離
目的是分開(kāi)樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類物質(zhì),，并不要求分離分子量相近的組分,。
2）分級(jí)分離
目的是分開(kāi)分子量不是很懸殊的大分子物質(zhì)。選擇凝膠型號(hào)時(shí)必須使各種物質(zhì)的Kd(分離系數(shù))值盡可能相差大一些,。
層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管,。層析柱的直徑大小不影響分離度,，樣品用量大,，可加大柱的直徑,，一般制備用凝膠柱,，直徑大于2厘米，但在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上,。此外,，直徑加大，洗脫液體體積增大,，樣品稀釋度大,。分離度取決于柱高,，為分離不同組分,，凝膠柱床必須有適宜的高度,，分離度與柱高的平方根相關(guān),，但由于軟凝膠柱過(guò)高擠壓變形阻塞,，一般不超過(guò)1米。分族分離時(shí)用短柱,，一般凝膠柱長(zhǎng)20-30厘米,，柱高與直徑的比較5:1─10:1,，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級(jí)分離時(shí)柱高與直徑之線為20:1─100:1,，常用凝膠柱有50×25厘米,，10×25厘米,。濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大,，被分離組分之間重新混合的可能性就大,，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象,，降低分辯力,。在精確分離時(shí)，死體積不能超過(guò)總床體積的1/1000,。
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