實時熒光定量PCR儀指的是在PCR進行的同時,，對其過程進行監(jiān)測的能力（即實時）,。因此,，數(shù)據(jù)可在PCR擴增過程中，而非PCR結(jié)束之后,，進行收集,。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在實時熒光定量PCR(qPCR)中,，反應(yīng)以循環(huán)中檢測到目標(biāo)擴增的時間點為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累計的擴增量,。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高,，則會越快觀察到熒光的顯著增加。相反,，終點法檢測（也稱“讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計的PCR產(chǎn)物量,。
實時熒光定量PCR儀注意事項：
1.在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中,，注意避免mRNA斷裂。
2.為了防止非特異性擴增,，必須設(shè)陰性對照,。
3.內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶),、β-Actin(β-肌動蛋白)等,。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,。
4.PCR不能進入平臺期,，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列,、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān),。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨實驗來確定,。
5.防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA樣品,，在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性,。
6.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
7.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,，故不能使用）,。
8.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌,，雙蒸水沖洗,，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗,，晾干,。
5
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務(wù)