熒光定量PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán),。開始時，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上,，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,，檢測不到熒光信號；PCR擴(kuò)增時,，Taq酶將探針酶切降解,，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。
熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)里,，熒光信號變化不大，接近一條直線,，這樣的直線即是基線,，這條線是可以自動生成也可以手動設(shè)置的。之后反應(yīng)會進(jìn)入指數(shù)增長期,，這個期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性,，在該期間，可設(shè)定一條熒光閾值線,，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,，但一般會將熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值,，這個值與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系,，且該值具有重現(xiàn)性。
熒光定量PCR特點有：
(1)用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量,，進(jìn)行實時動態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測,，避免終點定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染,，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程,。
(2)熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA,，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測物等方法獲得，打打提高了檢測的靈敏度,、特異性和準(zhǔn)確性,。Real-timeO-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測,、單核苷酸多態(tài)性的測定,、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測,。
5
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務(wù)