熒光定量PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,，該探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán),。開始時(shí)，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上,，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,，檢測(cè)不到熒光信號(hào)；PCR擴(kuò)增時(shí),，Taq酶將探針酶切降解,，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。
熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)里,，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線,，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動(dòng)生成也可以手動(dòng)設(shè)置的,。之后反應(yīng)會(huì)進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,，這個(gè)期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性，在該期間,，可設(shè)定一條熒光閾值線,，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,，但一般會(huì)將熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值,，這個(gè)值與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系,，且該值具有重現(xiàn)性。
熒光定量PCR特點(diǎn)有：
(1)用產(chǎn)生熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量,，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測(cè),，避免終點(diǎn)定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染,，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程,。
(2)熒光信號(hào)通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測(cè)物等方法獲得,，打打提高了檢測(cè)的靈敏度,、特異性和準(zhǔn)確性。Real-timeO-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究,、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè),、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定、細(xì)胞因子的表達(dá)分析,、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè),。
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