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實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀使用的基本步驟

閱讀:3949      發(fā)布時(shí)間:2022-4-12
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  實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀技術(shù)的原理:體外核酸擴(kuò)增,,加熱使雙鏈DNA解開(kāi)螺旋,在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交,,在Taq DNA聚合酶,,dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸),Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物,,重復(fù)“變性→退火一引物延伸”過(guò)程至25-40個(gè)循環(huán),,呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)。簡(jiǎn)單的說(shuō),,PCR儀就是利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)的大量合成,,基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù),,可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍,。
  實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀使用的基本步驟:
  ①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃(左右一定時(shí)間后,,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,;
  ②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,,溫度降至55℃左右,,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;
 ?、垡锏难由欤篋NA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
  實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程,,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍,。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。反應(yīng)初期,,靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式,,隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期,,即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,,這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類(lèi)和活性及非特異性產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素,。大多數(shù)情況下,,平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。

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