熒光定量PCR在反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加,。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,。從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線,。熒光擴(kuò)增曲線包括3個(gè)階段：基線期，擴(kuò)增期和平臺(tái)期,。
只有在熒光信號(hào)擴(kuò)增期,，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，所以可以在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較,，在熒光定量PCR反應(yīng)的指數(shù)期,，需要設(shè)定一定熒光信號(hào)的閾值，一般這個(gè)閾值是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本地信號(hào),，熒光閾值的缺省設(shè)置是3~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,。
熒光定量PCR的理論依據(jù)是什么？
特定的待擴(kuò)增基因片段起始含量越大,，則指數(shù)擴(kuò)增過程越短,，當(dāng)擴(kuò)增速率趨于穩(wěn)定后，則無(wú)論原來(lái)樣品中起始模板含量多少,，擴(kuò)增片段的含量通常是一樣的,。理想的擴(kuò)增結(jié)果：Y=X×2"其中Y代表擴(kuò)增產(chǎn)物量，X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù)n為擴(kuò)增次數(shù),；理論上PCR擴(kuò)增效率為100%,，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進(jìn)行成指數(shù)增長(zhǎng)，但實(shí)際上：DNA的每一次復(fù)制都不*,，即每一次擴(kuò)增中,，模板不是呈2的倍增長(zhǎng)；實(shí)際應(yīng)為：Y=X（1+E）",，其中E代表擴(kuò)增效率：E=參與復(fù)制的模板/總模板,，通常E≤1，E在整個(gè)PCR擴(kuò)增過程中不是固定不變的,。通常X在1~105拷貝,、循環(huán)次數(shù)n≤30時(shí)，E相對(duì)穩(wěn)定,，原始模板以相對(duì)固定的指數(shù)形式增加,，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期,；隨著循環(huán)次數(shù)n的增加（>30次）,，E值逐漸減少,，Y呈非固定的指數(shù)形式增加,，進(jìn)入平臺(tái)期。
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