酶聯(lián)免疫診斷試劑是指在酶標(biāo)板上包被相關(guān)的抗原（或抗體）后,，利用直接或間接的方法與待測(cè)樣品中的相關(guān)抗體（或抗原）反應(yīng),，形成的抗原抗體復(fù)合物再與相應(yīng)的酶標(biāo)記的抗體或抗原進(jìn)一步反應(yīng)，經(jīng)過酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng),，由形成的顏色的強(qiáng)弱來判斷樣本中相應(yīng)的抗體或抗原的存在,。
為了規(guī)范酶聯(lián)免疫診斷試劑的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，制定本技術(shù)指導(dǎo)原則,。
本指導(dǎo)原則適用于應(yīng)用酶聯(lián)免疫法的第三類診斷試劑（病原微生物）的生產(chǎn)和質(zhì)量控制,，其他類酶聯(lián)免疫診斷試劑參考本指導(dǎo)原則。國家藥品監(jiān)督管理部門將依據(jù)科學(xué)技術(shù)發(fā)展的需要，適時(shí)組織修訂,。
一,、基本原則
（一）酶聯(lián)免疫診斷試劑生產(chǎn)用的各種原料、輔料應(yīng)當(dāng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo),，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求,。
（二）酶聯(lián)免疫診斷試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員、儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境,，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》,；同時(shí)，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）》的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系,，形成文件和記錄,，加以實(shí)施并保持有效運(yùn)行；生產(chǎn)企業(yè)還應(yīng)該通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核,。
（三）酶聯(lián)免疫診斷試劑在研制時(shí)，應(yīng)當(dāng)遵循科學(xué),、規(guī)范的原則,，各反應(yīng)條件的選擇和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理。
（四）酶聯(lián)免疫診斷試劑生產(chǎn)過程中所用的各種材料及工藝,，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜,。
（五）生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標(biāo)：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定,、工藝可控,、檢測(cè)有效。
二,、原材料質(zhì)量控制
（一）主要生物原料
與診斷試劑的質(zhì)量zui密切相關(guān)的生物原料主要包括各種生物活性抗原,、重組抗原、單克隆杭體,、多克隆抗體以及多肽類,、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板,、標(biāo)記相關(guān)酶（辣根過氧化物酶,、堿性磷酸酶等）、中和反應(yīng)用抗原或抗體,、制備校準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品）等,。一般應(yīng)按照工藝要求對(duì)這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn),，其工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；若購買，其供應(yīng)商要求相對(duì)固定,，不能隨意變更供應(yīng)商,，如果主要原料（包括工藝）或其供應(yīng)商有變更，必須進(jìn)行原料驗(yàn)證,，并進(jìn)行補(bǔ)充申報(bào),。
主要生物原料的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目一般包括：
1、外觀
肉眼觀察,，大部分生物原料為澄清透明的液體,，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀,；或者為白色粉末,，不含有其他顏色的雜質(zhì)；特殊生物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn),。
2,、純度和分子量
主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進(jìn)行分析,，也可用其他適宜的方法,，如液相法等。根據(jù)所檢測(cè)生物原料的分子量選擇適宜丙烯酸胺凝膠濃度進(jìn)行電泳,。一般情況下,，每個(gè)電泳道加樣量為5μg，同時(shí)用已知分子量標(biāo)準(zhǔn)作參照,，采用合適的電泳電流和電泳時(shí)間,；電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量,。作為診斷試劑用生物原材料,，用銀染法染色后，純度一般都要大于90％,；用考馬斯亮藍(lán)染色后,，純度一般都要大于95％。
3,、蛋白濃度
蛋白濃度可通過Lowry法,、280nm 光吸收法、雙縮脲方法等進(jìn)行檢測(cè),；
4,、效價(jià)
效價(jià)的測(cè)定一般根據(jù)蛋白含量測(cè)定結(jié)果，通過倍比稀釋法進(jìn)行,。效價(jià)應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求,。
5、功能性實(shí)驗(yàn)
功能性實(shí)驗(yàn)是指生物原料用于試劑盒實(shí)際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑的靈敏度,、特異性和穩(wěn)定性等,，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。
（二）生物輔料
生物輔料指的是在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護(hù)劑用途的一類生物原料,，主要包括小牛血清,、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等,。這些生物原料均應(yīng)按照《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》所規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行檢驗(yàn),，達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后方應(yīng)用于生產(chǎn)。
生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對(duì)固定,，不得隨意變更供應(yīng)商,。
對(duì)于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等,，還應(yīng)進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn),，即以其為原料配制10％濃度的稀釋液作為樣品，進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定,，均不得出現(xiàn)非特異性反應(yīng),。
對(duì)于標(biāo)記用酶，應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶,、堿性磷酸酶等），同時(shí)應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢定方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn),，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應(yīng)大于3.0,。
（三）化學(xué)原材料
參照《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》分析純級(jí)別進(jìn)行檢驗(yàn)。主要的檢測(cè)指標(biāo)包括：溶液外觀,、一般鹽類檢測(cè),、溶液pH值檢測(cè)、溶解情況檢測(cè),、干燥失重的檢測(cè),、熾灼殘?jiān)取?/div>
主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對(duì)固定，不得隨意發(fā)生變更,?；瘜W(xué)原材料在購入時(shí)，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告,，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),。
（四）其他物料
1、酶標(biāo)板
（1）外觀
明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量,。如有欠注,、飛邊、骯臟、表面光潔度差,，底部有波紋及劃傷等應(yīng)剔除,。
（2）吸附能力和精密性
用一定濃度的正常人IgG包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結(jié)合物吸附,，通過顯色反應(yīng),，雙波長酶標(biāo)儀（主波長450nm，參考波長630nm）讀數(shù),。計(jì)算CV值,，批內(nèi)CV≤5％，批間CV≤10％,。
2,、液體試劑裝量瓶
包括陰陽性對(duì)照、樣品稀釋液,、洗滌液,、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分,，均應(yīng)有相應(yīng)的裝量瓶,，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規(guī)格,、裝量瓶的顏色,、瓶蓋的顏色等。
3,、其他材料
包括試劑瓶標(biāo)簽,、粘膠紙、鋁箔袋,、襯墊,、可密封塑料袋、說明書,、干燥劑和包裝外盒等,，均應(yīng)符合相應(yīng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如數(shù)量,、規(guī)格等,。
（五）企業(yè)質(zhì)控品
企業(yè)質(zhì)控品包括陰陽性參考品的符合率、靈敏度（zui低檢出量）,、靈敏度,、精密性（均一性）等質(zhì)控樣品，對(duì)于定量檢測(cè)試劑,，還包括線性質(zhì)控品樣品,。如該產(chǎn)品具有國家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品,，應(yīng)使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）進(jìn)行標(biāo)化；若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）,，則企業(yè)參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能低于國家藥品監(jiān)督管理部門已經(jīng)批復(fù)的*家試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),。
企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)與診斷試劑的待測(cè)樣品的基質(zhì)基本一致，如待測(cè)樣品為血清/血漿,，質(zhì)控品基質(zhì)也應(yīng)為血清/血漿,。
三、試劑盒各組分的生產(chǎn)
酶聯(lián)免疫診斷試劑盒主要組分的生產(chǎn)包括酶標(biāo)記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）,、各種工作溶液的配制,、包被酶標(biāo)反應(yīng)板、分裝及包裝等步驟,；并通過產(chǎn)品的半成品檢定和成品檢定兩個(gè)質(zhì)控過程來完成,。
（一）各種工作液的配制
酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液,、陰性陽性對(duì)照,、樣品稀釋液、洗滌液,、酶結(jié)合物或酶稀釋液,、底物或底物緩沖液、終止液等,，對(duì)定量檢測(cè)試劑,，還包括標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液。若陰性陽性對(duì)照或其他液體組分涉及生物安全性問題,，制備時(shí)應(yīng)在相應(yīng)的生物安全實(shí)驗(yàn)室完成,。
各種工作液在配制過程中應(yīng)嚴(yán)格按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的配方進(jìn)行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻,，同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量檢驗(yàn)并達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，方可使用或者分裝,。對(duì)于定量檢測(cè)試劑,，其標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液應(yīng)該在量值上具有溯源性。
應(yīng)對(duì)配制過程及配制的液體進(jìn)行的質(zhì)量控制,，主要包括酶結(jié)合物的功能性實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性,；各種溶液的外觀、pH值及電導(dǎo)率的測(cè)定等,；酶作用的底物應(yīng)測(cè)定在無相應(yīng)酶的情況下自身顯色的情況,，并制定合理的限定指標(biāo)；終止液應(yīng)對(duì)其終止酶促反應(yīng)的能力進(jìn)行測(cè)定,。
（二）包被酶標(biāo)反應(yīng)板
包被前應(yīng)對(duì)酶標(biāo)反應(yīng)板進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn),，如尺寸,、外觀、包裝,、吸附性能,、精密性等，并記錄酶標(biāo)反應(yīng)板的批號(hào),、數(shù)目,、標(biāo)識(shí)。酶標(biāo)反應(yīng)板經(jīng)檢驗(yàn)合格后方能用于包被,。不同批號(hào)的板條不能混用,。
選擇經(jīng)檢定合格的包被原料（如抗原、抗體等）,，經(jīng)一定的方法確定*包被濃度和酶結(jié)合物工作濃度,，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程，配制包被緩沖液,、封閉液,，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，包被酶標(biāo)反應(yīng)板,，經(jīng)干燥后,，已包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用鋁箔紙封閉（內(nèi)置干燥劑），抽真空后,，保存于2?8℃,。
應(yīng)對(duì)包被過程進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質(zhì)量檢驗(yàn),、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配方,、外觀、pH）,、包被過程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積,、溫度、濕度,、時(shí)間等）,、包被均一性檢驗(yàn)、干燥過程的監(jiān)控等,。
（三）分裝和包裝
樣品稀釋液,、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液,、底物或底物緩沖液等溶液應(yīng)嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的量進(jìn)行無菌處理后再分裝,，分裝量的誤差應(yīng)小于<5%。
分裝及包裝均應(yīng)按照相應(yīng)的SOP的要求進(jìn)行,。包裝前,，應(yīng)嚴(yán)格檢查試劑盒的品名,、批號(hào)等，核對(duì)各試劑盒各組分的數(shù)量,，并在關(guān)盒前進(jìn)行復(fù)核,。
四、質(zhì)量控制
（一）半成品質(zhì)量控制
1,、半成品抽樣
檢驗(yàn)人員按試劑的批號(hào),，根據(jù)抽樣申請(qǐng)單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各組分，作號(hào)標(biāo)記,、待檢,。
2、半成品檢驗(yàn)
利用上一批檢定合格的試劑盒的相應(yīng)組分,，對(duì)本批生產(chǎn)出的各種試劑盒組分分別進(jìn)行檢驗(yàn),，檢驗(yàn)結(jié)果達(dá)到產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
半成品檢驗(yàn),，一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的質(zhì)控品,。若某類試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品,，但該企業(yè)參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能低于國家藥品監(jiān)督管理部門已經(jīng)批復(fù)的*家試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),。
檢測(cè)所抽樣的半成品的試劑盒性能，包括陰陽性參考品的符合率,、靈敏度（zui低檢出量）,、精密性等，均應(yīng)達(dá)到相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求,，對(duì)精密性,，一般情況下CV不得高于15％（采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對(duì)定量檢測(cè)試劑,，同時(shí)應(yīng)分析其線性相關(guān)系數(shù)和校準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
企業(yè)應(yīng)該具有對(duì)每一批試劑的半成品進(jìn)行穩(wěn)定性研究。
（二）成品質(zhì)量控制
產(chǎn)品包裝完成后,，質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號(hào),、實(shí)際包裝量、抽樣申請(qǐng)單的要求進(jìn)行抽樣,，同時(shí)填寫抽樣數(shù)量和抽樣日期,，并且由抽樣人簽名,。抽樣數(shù)量應(yīng)包括檢定用數(shù)量和留樣數(shù)量,。質(zhì)檢人員同時(shí)應(yīng)檢查相關(guān)原始記錄。
每一批酶聯(lián)免疫診斷試劑報(bào)批批量zui低要求：達(dá)到1萬人份/批,。
1,、檢驗(yàn)
（1）成品檢驗(yàn)
一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）對(duì)成品進(jìn)行檢驗(yàn),，并達(dá)到質(zhì)控品的質(zhì)量要求。若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）,，則使用企業(yè)參考品,，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能低于國家藥品監(jiān)督管理部門已經(jīng)批復(fù)的*家試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)
在批放行前,，每一批酶聯(lián)免疫診斷試劑需具備穩(wěn)定性研究資料,。
