YIJI 線粒體呼吸鏈復(fù)合物 I 活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
主要用途
YIJI 線粒體呼吸鏈復(fù)合物 I（NADH－輔酶 Q 還原酶）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用合成
輔酶 Q 同功類似物和特異性抑制劑，通過(guò)反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定樣品中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧
化后峰值的降低,，即采用比色法測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法,。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心
研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的,。其適合于各種純化線粒體樣品（動(dòng)物,、人體、酵母）以及細(xì)胞或組織裂解懸液樣
品的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－輔酶 Q 還原酶的特異性活性檢測(cè),。其用于衰老,、能量代謝、
蛋白組學(xué),、病理生理學(xué),、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶,，嚴(yán)格無(wú)菌,，即到即用，操作簡(jiǎn)捷,，性
能穩(wěn)定,，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感,。
技術(shù)背景
線粒體呼吸鏈復(fù)合物I,，通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶Q還原酶（reduced nicotinamide adenine
dinucleotide coenzyme Q reductase,；NADH-CoQ reductase）,，又稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶
（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase）,，是線粒體電子傳遞鏈中
zui大的結(jié)構(gòu)成分：含有30至40多個(gè)多肽結(jié)構(gòu),。其特征性的酶活性是魚(yú)藤酮敏感的NADH－輔酶Q還原酶
（NADH:Q Reductase）。復(fù)合物I催化線粒體內(nèi)電子由供體NADH傳遞到內(nèi)膜上輔酶Q受體（泛醌,；
ubiquinone）的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng),，為整個(gè)呼吸鏈反應(yīng)系統(tǒng)的*步。基于輔酶Q底物,，在魚(yú)藤酮存在與否的情
況下,，通過(guò)NADH－輔酶Q還原酶的催化，轉(zhuǎn)化成還原型泛醌（CoQH2）,，同時(shí)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷
酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide,；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide
adenine dinucleotide；NAD）,，在分光光度儀下產(chǎn)生吸收峰值的變化（340nm 波長(zhǎng)）,，由此定量測(cè)定NADH
－輔酶Q還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是：
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI 緩沖液（Reagent A）
YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）
YIJI 陰性液（Reagent C）
YIJI 底物液（Reagent D）
YIJI 專性液（Reagent E）
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
毫升
毫升
毫升
微升
微升
1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里,，避免反復(fù)凍融,；YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸,；
YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）和 YIJI 底物液（Reagent D）,，避免光照，有效保證 6 月
用戶自備
比色皿：用于比色分析的容器
1

雙波長(zhǎng)分光光度儀：用于比色分析
培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化,；YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）和
YIJI 底物液（Reagent D）注意避光。然后進(jìn)行下列操作,。
一,、 測(cè)定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里（注意：檢測(cè)前溶解線粒體,；參見(jiàn)注意事項(xiàng) 5）
2． 設(shè)定好雙波長(zhǎng)分光光度儀（溫度為 30℃）：波長(zhǎng)分別為 340nm 和 380nm,，間隔 30 秒，讀數(shù) 7 次（共 3
分鐘）,，并置零（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng) 11）
二,、 背景對(duì)照測(cè)定
1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）
4． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
5． 加入 xx 微升 YIJI 陰性液（Reagent C）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),，此為背景空對(duì)照：
（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）0 分鐘－（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）1 分鐘或 3 分鐘
三,、 樣品總活性測(cè)定
1． 移取 xx 微升 YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI反應(yīng)液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）
4． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
5． 加入 xx 微升待測(cè)樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白；樣品須溶解,；參見(jiàn)注意事項(xiàng) 5）
6． 上下傾倒數(shù)次,，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：
（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）0 分鐘－（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）1 分鐘或 3 分鐘
四,、 樣品非特異活性測(cè)定
1． 移取 xx 微升 YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI反應(yīng)液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI專性液（Reagent E）
4． 加入 xx 微升 YIJI底物液（Reagent D）
5． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
6． 加入 100 微升待測(cè)樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白,；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng) 5）
2

7． 上下傾倒數(shù)次,，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),，此為樣品非特異活性讀數(shù)：
（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）0 分鐘－（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）1 分鐘或 3 分鐘
五,、 計(jì)算樣品活性
1）樣品活性（總活性或非特異活性）
【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）
單位＝微摩爾 NADH/分鐘
＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
2）樣品特異活性
樣品總活性測(cè)定－樣品非特異活性測(cè)定＝樣品特異活性
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為 21 次（10 個(gè)樣本）操作，包括背景對(duì)照測(cè)定
2． 操作時(shí),，須戴手套
3． YIJI反應(yīng)液（Reagent B）含有毒性物質(zhì),，避免直接用手接觸
4． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需 1 次
5． 線粒體樣品檢測(cè)前,，須溶解,；建議凍存融解（－70℃至 37℃）循環(huán) 3 次或使用 YIJI線粒體溶解
試劑盒－GMS10018
6． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后 3 秒內(nèi)即刻比色測(cè)定
7． 通常反應(yīng) 1 分鐘后比色測(cè)定值趨于穩(wěn)定；測(cè)定值由高到低變化,；測(cè)定可以持續(xù) 3 分鐘
8． 測(cè)定值由高到低變化,，即 3 分鐘測(cè)定讀數(shù)低于 0 分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性
9． 比色測(cè)定后,，比色皿須清洗*
10．通常比色測(cè)定的 OD340 起始讀數(shù) 0.5 為理想狀態(tài)
11．如果用戶沒(méi)有雙波長(zhǎng)同步測(cè)定分光光度儀,，可以使用單波長(zhǎng) 340nm 替代，注意活性計(jì)算時(shí),，毫摩爾吸
光系數(shù)變成 6.2
12．建議待測(cè)樣本線粒體蛋白濃度為 10 微克/100 微升,；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣
本量,；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供 YIJI線粒體溶解試劑盒 GMS10018 為后續(xù)的線粒體蛋
白濃度測(cè)定的預(yù)處理試劑盒和 YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 GMS30030.1）
13．如果使用細(xì)胞或組織裂解懸液,，則蛋白濃度為 50 微克/100 微升
14．樣品特異活性是指魚(yú)藤酮敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸－輔酶 Q 還原酶，去除其它干擾因素（例
如復(fù)合物 II/III/IV 等）
15．線粒體呼吸鏈復(fù)合物 I（NADH－輔酶 Q 還原酶）單位活性定義為：在 30℃,，pH 7.5 條件下,，每分鐘
內(nèi)能夠氧化 1 微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
16．本公司提供系列線粒體及其酶類技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確