RAPD-原理 

RAPD擴(kuò)增圖
RAPD,，即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù),，是由美國(guó)科學(xué)家Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出的,，又稱任意引物PCR,。它的應(yīng)用是基于這樣的一個(gè)推理：對(duì)于同一模板DNA，用同一引物擴(kuò)增既可能得到相同的帶譜（模板基因組間可能具有同源性）,，也可能得到不同的帶譜,。僅在某一特定模板中出現(xiàn)的條帶就可作為該模板的分子標(biāo)記。事實(shí)上,，不同基因組DNA總是一定差異的,，所以用就可以進(jìn)行分子標(biāo)記研究。理論上講,，在一定的擴(kuò)增條件下,，擴(kuò)增的條帶數(shù)取決于基因組的復(fù)雜性。對(duì)特定的引物,，復(fù)雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)也越多,。
90年代前期技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用,，幾乎所有的作物都有這方面的研究報(bào)告。但隨著研究的深入,，人們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定的缺陷,，并對(duì)此作了一些探索。

-特點(diǎn) 
技術(shù)目前運(yùn)用相當(dāng)廣泛,， 幾乎滲透于整個(gè)基因組研究的各個(gè)方面,， 這與它所具有的眾多優(yōu)勢(shì)是分不開的。

① 無(wú)需專門設(shè)計(jì) 擴(kuò)增反應(yīng)引物,，也無(wú)須預(yù)先知道被研究生物基因組的核苷酸序列,，引物可隨機(jī)合成和隨機(jī)選定，長(zhǎng)度一般為9- 10 個(gè)核苷酸,； 
② 每個(gè) 反應(yīng)中,，僅加單個(gè)引物，就可通過引物和模板DNA 隨機(jī)配對(duì)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增,，擴(kuò)增無(wú)特異性,； 
③ 退火溫度低，一般為36℃,，這樣的溫度能保證核苷酸引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合,，同時(shí)允許適當(dāng)?shù)腻e(cuò)誤配對(duì)，以擴(kuò)大引物在基因組DNA中配對(duì)的隨機(jī)性,，使 有較高的檢出率,；
④ 技術(shù)簡(jiǎn)便易行、省時(shí)省力,，不需要RFLP 分析的預(yù)備性工作：如克隆的制備,、同位素標(biāo)記、Southern 印記反應(yīng)及分子雜交,。 易于程序化,，利用一套隨機(jī)引物可得到大量的分子標(biāo)記，并可借助于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行分析,； 
⑤ 分析所需的DNA 樣品量極少,，僅為RFLP 的1ö 1000 - 1ö 200，這對(duì)于生物早期取樣鑒定或在DNA 受限制的情況下是十分有利的,。

-試驗(yàn)條件 

-原理
1. 藥品試劑
模板DNA（10～100ng）
寡核苷酸引物（20mmol/L貯存液,，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司購(gòu)買，也可以自己合成）

0.2 mmol/L dNTPs（必須使用高質(zhì)量的dNTPs,，這一點(diǎn)非常重要,。dNTPs經(jīng)反復(fù)化凍后會(huì)發(fā)生降解，因此應(yīng)分成小份保存,。應(yīng)注意混合物中四種dNTP的量要相等）

Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）

10×PCR緩沖液（500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris•HCl, pH 8.3）

礦物油

電泳所需試劑

2. 儀器設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀

電泳裝置

微量離心機(jī)

微量移液器（1～20ml和20～200ml）

0.5 ml Eppendorf管

-操作程序 
（1）在冰里向無(wú)菌的Eppendorf管中加入以下反應(yīng)物：

  水                 14.75 ml      
  10×緩沖液             2 ml 
  10×dNTPs              2 ml 
  引物（20 mmol/L）    0.2 ml 
  Taq DNA聚合酶   
  終體積    
  DNA（10～100ng）       1 ml 
  石蠟油                20 ml 

（2）93℃反應(yīng)2 min后開始如下循環(huán)：

 93℃變性反應(yīng)1min
 56℃退火反應(yīng)1min
 72℃延伸反應(yīng)1.5min
 經(jīng)過45個(gè)循環(huán)后,，zui后一個(gè)循環(huán)72℃增加5min,，循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于4℃保存。

（3）20ml反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳,，經(jīng)溴化乙錠染色檢測(cè)擴(kuò)增的情況,。

-試驗(yàn)注意及解決方法    
（1）擴(kuò)增偏差或無(wú)擴(kuò)增。

――在部分或全部管中缺少一個(gè)組分,。重復(fù)少量幾個(gè)反應(yīng)以確定所有的PCR組分是否都已加入,。
――PCR抑制物可能與DNA一起純化,，改變DNA的濃度,。
――在DNA分離中加入一個(gè)清洗步驟（如苯酚抽提）。
――稀釋新的DNA溶液,。
――引物母液失效,。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物濃度,。
――延長(zhǎng)退火時(shí)間（在PCR程序中的第二部分）,，或降低升溫轉(zhuǎn)換步驟之間的速率。
――提高每個(gè)反應(yīng)中的Taq聚合酶的濃度,。
――補(bǔ)加新的組分,，該滅菌的都高壓滅菌。

（2）擴(kuò)增結(jié)果差,，條帶模糊或難以辨認(rèn),。

――更換Taq聚合酶緩沖液。
――檢查引物（使用另外一個(gè)引物,，或者將引物末端標(biāo)記,，在16% 6mol/L尿素聚丙烯酰胺膠上電泳檢測(cè)）。
――檢查Taq聚合酶活性（與不同批量的酶作比較）,。
――改變DNA濃度,。

（3）高相對(duì)分子質(zhì)量產(chǎn)物彌散狀分布>4kb。

――降低DNA濃度,。
――降低Taq聚合酶濃度,。
――減少凝膠上樣量。
――可能是由于循環(huán)數(shù)過多的結(jié)果（Bell和Demarini 1991）,，減少循環(huán)數(shù),。
――確認(rèn)是否使用正確的緩沖液（不是水！）制備凝膠,。
――在較低的電壓下電泳,。

（4）在對(duì)照和所有檢測(cè)樣品中均為一條很強(qiáng)的單一帶。

――確認(rèn)引物序列不是回文結(jié)構(gòu),。這可能是引物多聚體造成的結(jié)果,。使用不同的引物,。

（5）帶譜不可重復(fù)。

――DNA過多或過少,。把基因組DNA濃度控制在10～100ng范圍之內(nèi),，DNA量太少時(shí)，“真正”靶序列與引物的結(jié)合效率低,，因此引物擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生假的條帶,，這就稱為引物偽跡；DNA量太多會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤配對(duì)（指引物與基因組DNA的配對(duì)）,。每個(gè)樣品進(jìn)行兩個(gè)不同DNA濃度的反應(yīng),。
――只考慮主要條帶。

（6）染色后凝膠背景太強(qiáng)影響分辨率,。

――減少染色時(shí)間,。
――凝膠脫色時(shí)間延長(zhǎng)。
――PCR反應(yīng)中DNA含量或Taq聚合酶過多,。

（7）低相對(duì)分子質(zhì)量產(chǎn)物分離不充分,。

――在更高濃度的瓊脂糖凝膠、專業(yè)純凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上分離產(chǎn)物,。

-技術(shù)問題及對(duì)策 
技術(shù)是由多種成分參加的生化反應(yīng),，反應(yīng)中各種成分均為微量，盡管其反應(yīng)靈敏度高,，但是影響因素較多,，會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性差等一些問題。為了得到較穩(wěn)定的結(jié)果,，各種反應(yīng)參數(shù)必須事先優(yōu)化選擇,，操作中每一步都必須小心謹(jǐn)慎，以防止出現(xiàn)差錯(cuò),。

1 溫度

一般反應(yīng)條件是：變性92－95℃,，常用94℃，30－60s,；延伸72℃,，60－120s；退火35－37℃,，30－60s,。變性和延伸溫度一般沒有太大變化，而退火溫度影響較大,。退火溫度低,，引物和模板結(jié)合特異性較差，出現(xiàn)的條帶可能增多；退火溫度高,，引物和模板結(jié)合特異性增加,。有人提出，在尋找基因差異為目的的實(shí)驗(yàn)中,，退火采用33－34℃效果更好,。在優(yōu)化方案中，退火溫度可能要提高,，以便降低背景,，得到少而清晰的＂帶＂。溫度的梯度率也是十分重要的,，特別是退火與延伸之間的梯度尤為重要,。各種儀器的控溫、升降溫性能均有差別,，一些儀器（如一些舊型號(hào)的儀器）在到達(dá)特定的溫度前就開始計(jì)時(shí),，一些PCR儀顯示的溫度與實(shí)際溫度會(huì)有差異,。這些在設(shè)計(jì)程序和結(jié)果分析時(shí)有必要考慮,，所以注明所用儀器的生產(chǎn)廠家、品牌,、規(guī)格,，就顯得很有必要，對(duì)于同一批實(shí)驗(yàn),，注意控制在同樣的溫度條件下進(jìn)行反應(yīng),，結(jié)果才有可比性。

2 反應(yīng)物的影響

PCR擴(kuò)增受多種成分的制約,，產(chǎn)物僅在部分循環(huán)中呈指數(shù)式（2）增長(zhǎng),，逐漸將達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，模板是關(guān)鍵制約因素之一,，產(chǎn)物取決于此,，實(shí)驗(yàn)中非常的模板濃度是十分關(guān)鍵的一個(gè)步驟。濃度過低,，分子碰撞機(jī)率低,，偶然性大，擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定,；濃度過高,，會(huì)增加非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物。更重要的是,，若循環(huán)數(shù)控制不好,，引物過早消耗完，后面循環(huán)中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3端會(huì)和原模板及每一次循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物退火,，造成不等長(zhǎng)度的延伸,。因此，如果原模板濃度過高,，非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物就足以形成背景,，這是高濃度模板造成彌散型產(chǎn)物的原因。相對(duì)而言,，模板純度影響不大,，即反應(yīng)液中蛋白質(zhì)、多糖,、RNA等大分子物質(zhì)影響不大,。理想的模板和引物濃度能產(chǎn)生多態(tài)性豐富、強(qiáng)弱帶分明的圖譜,。引物3端的重要性似乎更大,。此外，Mg＋2濃度也影響反應(yīng)的參數(shù)包括產(chǎn)物的特異性和引物二聚體的形成,，人們?cè)诟髯缘膶?shí)驗(yàn)中得出不同的結(jié)論,，大約在1.5－4mmol/L范圍內(nèi)?？傊?，各種反應(yīng)物的濃度應(yīng)事先進(jìn)行篩選優(yōu)化。

3 污染問題

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)空白對(duì)照,，因?yàn)橐?、各種緩沖液和雙蒸水都會(huì)造成污染。而且Taq酶也可能出現(xiàn)污染,，給分析帶來困難,，所以必須設(shè)置對(duì)照以排除系統(tǒng)誤差。并且,，酶也盡可能優(yōu)化,。

4 擴(kuò)增條帶的取舍

重復(fù)性問題 為了克服重復(fù)性差的問題，應(yīng)設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn),。作為DNA多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)的條帶是應(yīng)該可重復(fù)的，重復(fù)性好是zui重要的取舍指標(biāo),，而帶的強(qiáng)弱不應(yīng)該作為取舍的指標(biāo),。有學(xué)者認(rèn)為帶的強(qiáng)弱與其在基因組中的拷貝數(shù)有關(guān)。但據(jù)Thormann對(duì)十字花科植物分析,，產(chǎn)物的強(qiáng)弱與該產(chǎn)物在基因組中的拷貝數(shù)無(wú)直接關(guān)系,，而與引物及模板的同源性程度有關(guān)。分析一個(gè)位點(diǎn)時(shí)，要作全面分析,，若某一個(gè)體的全部帶均弱,，其模板可能有問題（濃度、分子量）,；若某一個(gè)體的大部分帶與其它個(gè)體強(qiáng)度一致,，僅有一條或少數(shù)幾條帶弱，可能存在拷貝數(shù)差異,。重復(fù)性不好的弱帶（無(wú)規(guī)律出現(xiàn)的帶）可能由非專一性擴(kuò)增,、產(chǎn)物間退火或其它人為因素造成，不能記錄,。

異源雙鏈問題 Ayliffe研究亞麻銹病菌時(shí)發(fā)現(xiàn)F1代中出現(xiàn)的一條帶在親本中沒有出現(xiàn),，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這一條帶是由2個(gè)等位基因組成的異源雙鏈形成的，這2個(gè)等位基因除中間插入的38bp的序列外,，其余序列相同,。這種條帶可以在后代中遺傳，在該研究中這種條帶大約占0.16％,。在蜜蜂的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的問題,，這種條帶可以用單鏈核酸酶將其消除。也可以將電泳溫度提高到60℃以上,，使異源雙鏈變性,，以消除其影響,。

非孟德爾遺傳的條帶 Heun等分析認(rèn)為,，在顯示多態(tài)性的非模糊條帶中有92.5％的表現(xiàn)為孟德爾顯性遺傳，其余的條帶不符合孟德爾遺傳,，分析認(rèn)為可能由不同的序列組成,。一般實(shí)驗(yàn)中大多采用符合孟德爾遺傳的條帶進(jìn)行分析。在連鎖圖譜分析中,，基因型錯(cuò)誤可以部分消除,，即在F1代或1：1混合物中沒有出現(xiàn)的條帶，在其父母本中應(yīng)盡可能去掉,。

同一條帶的同源性問題 Thormann將產(chǎn)物標(biāo)記作探針,，雜交結(jié)果表明，與探針片斷遷移率一致的帶有時(shí)并不同源,，這種情況僅發(fā)生在種間,。并比較了RFLP和標(biāo)記在種內(nèi)和種間得出的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RFLP和標(biāo)記在種內(nèi)水平的結(jié)果*吻合,，但在種以上等級(jí)的結(jié)果相差甚遠(yuǎn),，這說明在電泳結(jié)果的同一個(gè)帶中，有可能存在序列不同但分子量相同的幾條帶，無(wú)法檢測(cè),。這種可能在種內(nèi)較少發(fā)生,，而這種間可能性較大，Castagna用RFLP和比較研究也得出了相同的結(jié)論,。

5 電泳分辨率問題

電泳時(shí),，基因組不同位置的擴(kuò)增產(chǎn)物共同移動(dòng)的可能性是有的，即不同分子量的擴(kuò)增產(chǎn)物可能在電泳時(shí)沒有分開而形成一條帶,，凝膠分離系統(tǒng)和基因組的親緣關(guān)系有可能提高這種概率,。一般而言，聚丙烯酰胺和銀染的分辨效果比瓊脂糖和溴化乙銨要高,，用較長(zhǎng)（可達(dá)到20cm）或濃度更高（2%）的瓊脂糖凝膠有助于提高分辨率,。當(dāng)然，隨著分辨率和靈敏度的提高,，更可能出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)誤差,。所以有人評(píng)述：zui保險(xiǎn)而簡(jiǎn)單的方法是用瓊脂糖電脈分離而且只注意那些無(wú)疑而重發(fā)性高的帶。但是,，聚丙烯酰胺和銀染所揭示的高信息量的多態(tài)性無(wú)疑可加快分子標(biāo)記的鑒定過程,。

6 顯性標(biāo)記問題

標(biāo)記來自于模板DNA的復(fù)制，經(jīng)過30一40次循環(huán),，擴(kuò)增條帶數(shù)量理論上可達(dá)2,。原模板中擴(kuò)增位點(diǎn)是純合還是雜合已無(wú)法判斷，因?yàn)榧兒衔稽c(diǎn)的擴(kuò)增條帶只相當(dāng)于雜合位點(diǎn)的2倍,，電泳時(shí)無(wú)法檢測(cè)到其差別,。雜交中。如果親本一方為純合體,，F(xiàn)1代就可以全部表現(xiàn)出該條帶,；如為雜合體，該條帶在F1中應(yīng)為l：l分離,，即一半后代有該條帶,，而另一半則沒有。當(dāng)然來自于多拷貝區(qū)的條帶分析更為復(fù)雜,。

-應(yīng)用問題及策略
1 遺傳圖譜構(gòu)建的問題

分析樣品
是一種顯性標(biāo)記,，符合孟德爾遺傳定律，不能區(qū)分雜合型和純合型,，因此在遺傳分析及遺傳圖譜的構(gòu)建等一些方面受到限制,。目前，在實(shí)踐中,，主要利用了以下2種方法,。
①利用單倍體 利用胚乳進(jìn)行分析,，可以克服構(gòu)建遺傳圖譜中這些困難。因?yàn)獒樔~樹的胚乳是單倍體,，記錄了雜合的母本染色體組在減數(shù)分裂過程中的遺傳事件,，不存在雜合型，進(jìn)行遺傳分析時(shí),，與共顯性標(biāo)記具有同樣的遺傳行為,，是天然的優(yōu)良作圖材料。現(xiàn)在已進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建的有濕地松,、歐洲赤松,、火炬松、楊樹,、日本柳杉和桉樹,。但是由于缺乏細(xì)胞遺傳學(xué)的研究，暫時(shí)還不能確定連鎖群和染色體之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,。

②將條帶作為單劑量標(biāo)記,，單劑量標(biāo)記（Single-dose markers）是從兩物種和其雜交產(chǎn)生F1代的分子標(biāo)記中選擇的。選擇構(gòu)建圖譜用的標(biāo)記有2個(gè)原則：A,、它們必須在一個(gè)親本中存在而在另一個(gè)親本中不存在,；B、它們?cè)诤蟠斜仨氁詌：1分離,。這種方法相當(dāng)于一個(gè)雜合體和一個(gè)隱性純合體的測(cè)交,，稱為雙向假測(cè)交（Two-way pseudo-testcross）。在多倍體植物中,，不論基因組是如何組成的（異源多倍體或同源多倍體）,，也不論材料的多倍性水平如何，單劑量的標(biāo)記都相當(dāng)于簡(jiǎn)單的等位基因（同源多倍體）或相當(dāng)于二倍體基因座上的雜合等位基因（異源多倍體）,。因此根據(jù)這些單劑量標(biāo)記的連鎖情況可以構(gòu)建分子圖譜,。條帶作為單劑量標(biāo)記使那些基因組DNA含zui大，世代周期長(zhǎng)的喬木和多倍體植物的遺傳圖譜研究走出了幾乎停滯的狀態(tài),。Grattapagalia利用這種策略首先構(gòu)建了巨桉和尾葉桉的分子連鎖圖譜。Conner利用這種策略構(gòu)建了3個(gè)蘋果品種的分子圖譜,。Mudge利用甘蔗及雜交后代的條帶作為單劑量標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析構(gòu)建了甜根子草的51個(gè)連鎖群,，并分析了其染色體組的數(shù)目。雖然這些連鎖圖譜是個(gè)體特異性的,，但可以為數(shù)量性狀定位提供框架結(jié)構(gòu),，為標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

2 系統(tǒng)學(xué)研究中的問題

系統(tǒng)學(xué)是研究zui為迅速的領(lǐng)域,，許多作物都用作過親緣關(guān)系分析,，大部分結(jié)果和形態(tài)分類結(jié)果相類似,，僅有少數(shù)例外。但是近年來,，有人對(duì)其結(jié)果的可靠性提出不同的看法,，主要有以下幾點(diǎn)：

①由于引物的競(jìng)爭(zhēng)性等，基因組的位點(diǎn)有時(shí)不能全部檢出,，造成假象上的差異,。根據(jù)這種情況，可以認(rèn)為,，可以應(yīng)用于種間乃至近緣屬之間關(guān)系的研究,，但有一定的局限性。因不同種度的擴(kuò)增產(chǎn)物難以作同源性分析,，只能作表征分析,，從而只能從相似性或遺傳距離上去分析親緣關(guān)系。其結(jié)果可能與真實(shí)的系統(tǒng)關(guān)系相左,。

②因在種間或?qū)匍g的變異水平很高,，取樣代表性是一個(gè)較大的問題，即利用某一個(gè)體代表一個(gè)種或用一個(gè)種代表一個(gè)屬都可能造成結(jié)果的偏差,。因而,，能找到群體特異或種特異性的條帶。

③在表征分析中另一個(gè)值得注意的問題是一些產(chǎn)物的出現(xiàn)存在相關(guān)關(guān)系,，即一個(gè)位點(diǎn)與另一個(gè)位點(diǎn)相連鎖,。若將這個(gè)差異單獨(dú)計(jì)算，相當(dāng)于對(duì)某一性狀極度加權(quán),。

④在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析中,，因?yàn)闂l帶具有顯性的遺傳特征，多態(tài)性信息量較低,。如果其符合二歧分枝樹的假定,，就可以對(duì)變化的性狀予以加權(quán)，并進(jìn)行分析,。但是許多植物的核基因組是有性的二倍體,，而且它們的進(jìn)化歷史是網(wǎng)狀分枝樹，不便于分析,。通常認(rèn)為葉綠體,、線粒體和有些細(xì)菌及真菌的病原體符合二歧分枝樹的假定。但由于其基因組較小,，沒有重組,，它們的信息量只相當(dāng)于核基因組中具有多個(gè)等位基因的一個(gè)同工酶座位，這樣估算的基因多樣性值的標(biāo)準(zhǔn)差理論上會(huì)比有多個(gè)核基因蛋白座位得出的大,。其非編碼區(qū)在一些動(dòng)物類群中的進(jìn)化速度很快,，因此做種上水平研究時(shí)將會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,，但種下水平影響較小。

⑤和農(nóng)藝性狀的系統(tǒng)分析比較說明,，二者相差不大,，沒有出現(xiàn)相反的情況。而且比農(nóng)藝性狀提供了更多的遺傳信息,。

總之,，用作系統(tǒng)分析應(yīng)結(jié)合其它方法，結(jié)果才更有說服力,。

3 標(biāo)記,、定位目的基因

標(biāo)記、定位目的基因是相對(duì)較為緩慢的一個(gè)領(lǐng)域,，這是因?yàn)闃?biāo)記探測(cè)的是整個(gè)基因組的變化,，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，要和基因位點(diǎn)起來有一定的困難,。一般的變異群體性狀的變化涉及到基因組內(nèi)較大的范圍（微效多基因）,，不可能全部檢出。而且檢出的多態(tài)性又不一定是性狀變異的標(biāo)志（可能擴(kuò)增于非編碼區(qū)）,。另一困難是擴(kuò)增的特異性片段有些為重復(fù)序列,，轉(zhuǎn)化為RFLP探針有一定困難。據(jù)Grattapaglia用48個(gè)片段所作的雜交實(shí)驗(yàn)表明,，有53%來自于低拷貝區(qū)（1000）,。這只有通過篩選出與單拷貝區(qū)連鎖的標(biāo)記予以解決。如果標(biāo)記和基因位點(diǎn)或性狀不能起來,，其實(shí)用價(jià)值就會(huì)大大降低,。為此人們作了以下探索。

①利用易位系,、回復(fù)突變系,、等位基因系、近交重組系等特殊材料 從理論上講,，除目的基因及鄰近區(qū)域外,，其它部分*一致。如果檢測(cè)出多態(tài)性,，差異必定在目的基因及鄰近區(qū)中,，也就是說標(biāo)記在這個(gè)范圍內(nèi)與目的基因連鎖。但是要獲得這些材料比較困難,，例如等位基因系需要回交20代，時(shí)間太長(zhǎng),。分析中一般用近等位基因系NILs（Near isogenic lines）,，回交6代以上即可,。回交6代時(shí),，供體DNA的比例為l/128,，用找到的與目的基因連鎖的標(biāo)記與目的基因在距離上還相當(dāng)遠(yuǎn)。

②集團(tuán)分離法（BSA）對(duì)不存在上述特殊生物模型的群體,，可采用這種方法,。即利用F2分離群體為材料，根據(jù)目的基因的表型把F2群體分為2群（例如抗病的和不抗的）,，每一群中將各個(gè)體DNA等量混合,，這樣形成2個(gè)DNA混合池。在每個(gè)基因池中,，不管群體性狀如何,，在目的基因的表型上都是一致的，2個(gè)群體之間,，目的基因的表型都是相反的,。因此，在2個(gè)群體之間*不同,、在每個(gè)群體之內(nèi)各個(gè)體間又是*相同的擴(kuò)增產(chǎn)物即可認(rèn)為是與目的基因連鎖的標(biāo)記,。這種方法相當(dāng)于把分析材料作為近等位基因系。

在找到合適的分子標(biāo)記后,，既可直接用于輔助選擇育種（Molecule-marker assisted selection,，MAS），也可通過對(duì)特異片段的分離和兩端測(cè)序?qū)⒅D(zhuǎn)換為序列標(biāo)志位點(diǎn)（Sequence-tagged sites,，STS）,。從這個(gè)分子標(biāo)記出發(fā)找到目的基因需經(jīng)過幾個(gè)步驟：A、用稀有切點(diǎn)內(nèi)切酶將基因組DNA切成大片斷DNA,；B,、用脈沖電泳分離大片斷DNA；C,、將大片斷DNA克隆到Y(jié)AC（Yeast artificial chromosome）中,，建立YAC文庫(kù)；D,、以顯示多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物為探針從YAC文庫(kù)中調(diào)出含有該標(biāo)記和與其連鎖的目的基因的大片斷DNA,；E、以該標(biāo)記為起點(diǎn)向目的基因進(jìn)行染色體滑步或跳躍,，以找到目的基因,。Michelmore首先利用這種方法找到了萵苣抗性基因的標(biāo)記，Koller等利用這種方法找到與蘋果瘡痂病抗性基因有關(guān)的分子標(biāo)記,。

③利用一套缺體一四體系或雙端體系,，以獲得與目的基因連鎖的標(biāo)記引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，然后進(jìn)行原位雜交,，確定特異性帶在染色體上的位置,。

這些工作在一些基礎(chǔ)研究較多的領(lǐng)域或與人類關(guān)系較為密切的物種中進(jìn)展較為迅速,，比如小麥,、水稻找到的分子標(biāo)記已有許多。但林木等多年生植物研究進(jìn)展稍遲滯,，關(guān)鍵是缺乏合適的群體,。

4 純度和外源基因檢驗(yàn)問題

雖然由于條帶的靈敏和重復(fù)性等問題,，純度檢驗(yàn)研究還只停留在實(shí)驗(yàn)階段,。但已有的對(duì)大麥,、玉米,、大豆、棉花,、小麥、水稻的實(shí)驗(yàn)表明,，技術(shù)是鑒定品種的有效方法。相信其在純度檢驗(yàn)和保護(hù)方面會(huì)取得較為廣泛的應(yīng)用,。

- 技術(shù)與PCR 技術(shù)區(qū)別 編輯本段回目錄
技術(shù)源于PCR 技術(shù),，但又不同于PCR 技術(shù)，差別主要體現(xiàn)在隨機(jī)擴(kuò)增引物上,。首先,，隨機(jī)擴(kuò)增引物是單個(gè)加入，而不是成對(duì)（正,、反向引物） 加入,， 其次， 隨機(jī)引物短,，一般 技術(shù)采用的引物含10 個(gè)堿基，由于隨機(jī)引物較短,，與常規(guī)PCR 相比,， 退火溫度較低，一般為35 - 45 ℃。
技術(shù)以一系列隨機(jī)引物對(duì)基因組進(jìn)行檢測(cè),，因而能檢測(cè)多個(gè)基因位點(diǎn)，覆蓋率比較大,，并且引物越多,，覆蓋面越廣，遺傳信息也隨之增加,，因此 多態(tài)信息含量（ PIC） 值波動(dòng)較大，在0. 2 - 0. 9 之間,。另外， 指紋呈孟德爾式顯性遺傳,。

-中藥材鑒定中的作用 
1. 植物藥材相近種類的鑒定

邵鵬柱等在1994 年報(bào)道了對(duì)中藥材人參與西洋參采用Ap2PCR 標(biāo)記進(jìn)行鑒別，他們采用20 個(gè)堿基的Galk ,，Seq2 ,，24 個(gè)堿基的MB forward ,，MB reverse 和27 個(gè)堿基的OTCSbackward 作引物成功地利用AP2PCR 指紋圖譜技術(shù)鑒定出人參和西洋參。1995 年分離人參屬三種植物人參,、西洋參、三七（P. notoginseng） 和四種偽品包括桔梗,、紫茉莉、櫨蘭、商陸的基因組DNA ,，分別采用10 個(gè)堿基的OPC25 和OPC220 作引物,，用 標(biāo)記可以明顯地區(qū)別,，說明DNA 分子也能區(qū)別人參屬三個(gè)品種和人參及其偽品。中國(guó)南方部分省區(qū)有多種菊科不同屬的植物如地膽草,、一點(diǎn)紅、苦荬菜,、毛大子草,、山萵苣,、苦苣菜以“土公英”混作蒲公英使用。曹暉等利用Ap2PCR 和分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蒲公英及六種土公英混淆品進(jìn)行了DNA 指紋鑒別研究,，結(jié)果顯示它們的DNA 指紋圖譜存在明顯差異，利用這種差異可以從分子水平上鑒別蒲公英及其混淆品,。Kohjyouma M 等采用CTAB 法提取菊科蒼術(shù)屬五種植物茅蒼術(shù)、北蒼術(shù),、單葉蒼術(shù),、關(guān)蒼術(shù)和白術(shù)等新鮮葉片組織的基因組DNA ，利用 技術(shù)獲得了清晰的多態(tài)性DNA 指紋圖譜,，能明顯地區(qū)分蒼術(shù)的幾個(gè)品種,，發(fā)現(xiàn)在基因水平上單葉蒼術(shù)與茅蒼術(shù)十分接近，而與白術(shù)和關(guān)蒼術(shù)相距較遠(yuǎn),，后兩者與北蒼術(shù)又相近似,。這一結(jié)果與PFL P （ Restriction fragmentlength polymorphism） 方法得到的結(jié)果相近。說明 能有效地鑒別蒼術(shù)屬植物,。

2. 植物藥材基原的鑒定

Yamazaki M 等采用酸性緩沖液提取法分離了4 種菊科甘草屬植物光果甘草,、甘草、刺毛甘草和刺果甘草的基因組DNA ,，通過對(duì) 指紋圖譜分析，表明光果甘草與甘草遺傳關(guān)系非常接近,，刺毛甘草和刺果甘草的遺傳關(guān)系相距較遠(yuǎn),，這種結(jié)果與RFL P 所得結(jié)果類似，也與植物分類學(xué)研究吻合,。他們進(jìn)一步對(duì)4 種商品甘草藥材（新疆甘草,、西北甘草、西伯利亞甘草,、阿富汗甘草） 采用 方法作遺傳距離估算,，來對(duì)其進(jìn)行基原鑒別，逐步證實(shí)了阿富汗甘草來源于光果甘草,、西伯利亞甘草來源于甘草,、新疆甘草和西北甘草來源于刺果甘草。曹暉等以CTAB 微量提取法分離菊科植物地膽草,、白花地膽草和假地膽草以及四種商品苦地膽藥材的基因組DNA ,，采用長(zhǎng)引MBforward（24 個(gè)堿基） ,，GalK（20 個(gè)堿基） 進(jìn)行AP2PCR 擴(kuò)增和用OPC26 （10 個(gè)堿基） 的短引物進(jìn)行 擴(kuò)增，獲得清晰可靠的DNA 指紋圖譜,，根據(jù)DNA帶型差異鑒別出地膽草及其混淆品,。同時(shí)通過對(duì)DNA 指紋圖譜的相似度指數(shù)值計(jì)算， 證實(shí)四種商品藥材苦地膽的基原為菊科植物地膽草,。                                                                                                                                            

3. 復(fù)方制劑,、粉劑中藥材品種的鑒定

中藥材復(fù)方制劑、粉劑等由于其中的各種生藥外觀性狀*遭到破壞,，要了解某味藥是否存在,，用傳統(tǒng)的鑒定方法有時(shí)難以奏效。但是使用 技術(shù)時(shí),，從理論上來講,，如果只要能制備出該種藥材的高度特異性的寡核酸引物，即可達(dá)到鑒定的目的,。Ozeki 等采用GTC（異硫氰酸胍） 微量提取法分離人參屬三種植物人參,、西洋參和竹節(jié)參以及兩種人參制劑高麗紅參泡茶OTANECHAN（日本的一種人參組織培養(yǎng)物制成的茶） 的基因組DNA ，通過 分析,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參的根毛組織和干燥藥材產(chǎn)生相同的 指紋圖形,，人參、西洋參和竹節(jié)參之間采用不同的引物產(chǎn)生不同的 指紋圖,；高麗紅參泡茶中幾乎沒有DNA 片段擴(kuò)增（ 其提取物無(wú)DNA 模板之故） ,， 但從OTANECHAN 中擴(kuò)增到了與人參愈傷組織相同 指紋的DNA 片段。這表明了 技術(shù)應(yīng)用于中藥傳統(tǒng)制劑中組分鑒別的可能性,。黃璐琦等對(duì)來源于已于13 個(gè)種3 個(gè)變種的天花粉及其類似品共26 份樣品,，用8 個(gè)擴(kuò)增多態(tài)性好的引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，得到清晰,、穩(wěn)定的條帶83 條,，然后采取聚類分析的方法。結(jié)果表明全部樣品可被有效地分為三大類：*類是大宗商品和小宗商品,，第二類是天花粉藥材商品中極易混淆的湖北栝樓根和紅花栝樓根，第三類全部是混淆品和地區(qū)習(xí)慣用藥,。對(duì)不同植物來源的天花粉,，尤其是對(duì)來自不同組或組上水平的天花粉采 技術(shù)能夠很好地把它們區(qū)別開來，其結(jié)果與物種間的親緣關(guān)系基本一致,。這為解決粉末及破碎藥材的鑒定提供了新的方法,。

4.  動(dòng)物藥材的鑒定

目前這方面的文獻(xiàn)報(bào)道比較少。王義權(quán)等成功地將 技術(shù)應(yīng)用于六種蛇類的基因組DNA的多態(tài)性檢測(cè),，在20 個(gè)引物中找出16 個(gè)引物產(chǎn)生了253 個(gè)擴(kuò)增片段,，準(zhǔn)確地區(qū)別了游蛇科5 個(gè)種和蝰蛇科1 個(gè)種,，片段分布和片段共享度聚類分析所得的游蛇科5 種蛇之間的親緣關(guān)系與染色體、顱骨和陰莖研究的結(jié)果基本一致,。顯示DNA 分子標(biāo)記技術(shù)可以成為一種準(zhǔn)確鑒別蛇類藥材的新方法,， 同樣適合于動(dòng)物中藥材的鑒定。

5. 藥材的野生類型與栽培品種的鑒定

由于生態(tài)環(huán)境的改變和人們生產(chǎn)活動(dòng)的影響,，中藥材遺傳特性及其生藥品質(zhì)在一定程度上產(chǎn)生了變化,，產(chǎn)地和栽培也對(duì)生藥品質(zhì)和藥性產(chǎn)生巨大影響。在人類回歸自然呼聲日益高漲的今天,，人們普遍認(rèn)為野生品比栽培品要好,。同時(shí)，由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使,，以栽培品冒充野生品的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,，給臨床造成混亂。因野生品和栽培品來自同一個(gè)物種,，植物形態(tài),、藥材性狀、化學(xué)成分,、生物活性等往往無(wú)明顯差異,，這就需要尋找一種有效的方法進(jìn)行鑒別， 等分子標(biāo)記的產(chǎn)生為這種鑒定提供了良好的應(yīng)用前景,。馬小軍等利用,、A FL P 標(biāo)記對(duì)人參、圓參與山參品種的研究中發(fā)現(xiàn),，,、AFLP 標(biāo)記可以用于野生與栽培品種的鑒別，其長(zhǎng)脖類型更接近野生人參,。

6. 道地藥材鑒定

道地藥材是人們?cè)陂L(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中,，經(jīng)臨床總結(jié)作為評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的綜合標(biāo)準(zhǔn)。它是一種長(zhǎng)期進(jìn)化和生態(tài)適應(yīng)過程中,，某一物種的變種,、生態(tài)型、品種或居群適應(yīng)于特定的生態(tài)地理環(huán)境條件所形成的優(yōu)良種質(zhì)資源,。道地藥材的研究,，包括其形成與鑒定，過去主要集中于化學(xué),、藥理研究,，從DNA 標(biāo)記水平的報(bào)道很少。胡珊梅等用技術(shù)探討澤瀉道地藥材與非道地藥材之間遺傳變異的大小， 并建立了道地藥材的品質(zhì)鑒定方法,，為道地藥材研究提供了有益的啟示,。可以預(yù)見,，借助分子標(biāo)記,，對(duì)道地藥材的快速、準(zhǔn)確鑒定,，無(wú)疑會(huì)給我們提供新思維,、新視野。

-分子生藥學(xué)中的應(yīng)用 
目前,，標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于分子生藥學(xué)各方面：

①生物多樣性：隨著植物藥研究的不斷深入,，可持續(xù)開發(fā)利用藥用植物資源的問題越來越受到重視。應(yīng)用技術(shù)進(jìn)行藥用植物生物多樣性研究,，可以在遺傳多樣性水平上了解天然產(chǎn)物多樣性與物種,、生態(tài)及地理分布的關(guān)系，挖掘潛在的藥物資源,，為開發(fā)新藥尋找途徑,。方法可以檢測(cè)物種的遺傳多樣性，探討物種的親緣關(guān)系和進(jìn)化趨勢(shì),。因此它是藥用植物資源保護(hù)和種質(zhì)資源保存的依據(jù),，特別是對(duì)瀕危物種的研究更具有實(shí)際意義。

②標(biāo)記可用于生藥分類,，在DNA分子水平上鑒別生物不同種,、亞種、變種甚至株,。

③標(biāo)記可用來制作生物類生藥系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上的樹狀圖,，特別是種內(nèi)水平。這為生藥親緣進(jìn)化關(guān)系,尋找新的藥用資源開辟了新途徑,。

④標(biāo)記可用于構(gòu)建基因圖譜,，進(jìn)行基因定位，和對(duì)未知序列的DNApian段擴(kuò)增與測(cè)序,。

⑤標(biāo)記亦可用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建,，指導(dǎo)藥用植物育種，防止品種間雜化和自交,，選育優(yōu)良性狀的品