載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體,。
一、一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素
復(fù)制起始位點(diǎn)Oril 即控制復(fù)制起始的位點(diǎn),。原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn),。而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。
?？股乜剐曰?可以便于加以檢測(cè),，如Amp+l ,Kan+
＃多克隆位點(diǎn)MCS 克隆攜帶外源基因片段l
＃P/E 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子l
＃Termsl 終止信號(hào)
＃加poly（A）信號(hào)l 可以起到穩(wěn)定mRNA作用
二、如何閱讀質(zhì)粒圖譜
*步：首先看Ori的位置,，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）
第二步：再看篩選標(biāo)記,，如抗性,，決定使用什么篩選標(biāo)記。
（1）Ampr 水解β－內(nèi)酰胺環(huán),，解除氨芐的毒性,。
（2）tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。
（3）camr 生成氯霉素羥乙?；苌铮怪ザ拘?。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418（長(zhǎng)那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活,。
第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn),。便于外源基因的插入,。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活,，而便于篩選,。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小,。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DN***段,。一般來(lái)說(shuō)，外源DN***段越長(zhǎng),，越難插入,，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低,。
第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件,，即啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這是用來(lái)區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體,?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體,，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩,。
啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)
＃啟動(dòng)子－促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，這個(gè)DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游,，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的部位,，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。l
＃增強(qiáng)子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控順序,。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無(wú)關(guān),。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負(fù)增強(qiáng)子,，負(fù)調(diào)控序列,。l
＃核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),，對(duì)于原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列。l
＃轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的zui后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列,，此位點(diǎn)down－stream有一段GT或T富豐區(qū),，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號(hào)。結(jié)構(gòu)基因的zui后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列,，此位點(diǎn)down－stream有一段GT或T富豐區(qū),，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號(hào)。l回答有人之前提出的一個(gè)問(wèn)題：為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針,，那其實(shí)是代表兩條DNA鏈,，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上,，而它的抗性基因在另一條鏈上.
三,、介紹一下關(guān)于載體的知識(shí)（雖然課本上都有寫）
1. 什么是載體
即要把一個(gè)有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過(guò)基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞,，這種運(yùn)載工具就叫做載體（vector）,。
P.S.基因工程所用的vector實(shí)際上是DNA分子，是用來(lái)攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA
2. 載體的分類
＃按功能分成：
（1）克隆載體都有一個(gè)松弛的復(fù)制子,，能帶動(dòng)外源基因,，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。它是用來(lái)克隆和擴(kuò)增DN***段（基因）的載體,。（所以有時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)擴(kuò)增效率低下,，要注意是不是使用的嚴(yán)謹(jǐn)行載體）
（2）表達(dá)載體具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。
＃按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分：（1）原核載體 （2）真核載體（3）穿梭載體（sbuttle vector）指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子,，因而可以運(yùn)載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）.
P.S. 穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個(gè)復(fù)制子,，以確保兩類細(xì)胞中都能擴(kuò)增。
3. 基因工程載體的3個(gè)特點(diǎn)：
（一）都能獨(dú)立自主的復(fù)制：載體DNA分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域,，如MCS,，插在其中的外源DN***段，能被動(dòng)的跟著載體一起復(fù)制/擴(kuò)增,，就像載體的正常成分一樣,。
（二）都能便利的加以檢測(cè)：如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因,，將受體細(xì)胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí),，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。
（三）都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去,，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái),。
4. 載體的選擇和制備：選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn),。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因,，則要選擇合適的表達(dá)載體,。
載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：
【1】構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá),，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體,。
【2】.載體的類型：
--－（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大小（大選大,，小選?。Ｈ?lt;10kb選質(zhì)粒,。
--－（2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型－原核/真核/穿梭,，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。
--－（3）對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意3點(diǎn)：
------①選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌,；
------②用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位；
------③表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考,。
【3】載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異,，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位,。
選用質(zhì)粒（zui常用）做載體的4點(diǎn)要求：
①選分子量小的質(zhì)粒,，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）,；
②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束,，一般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè),。
③必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn),，有選擇的余地；
④必需有易檢測(cè)的標(biāo)記,，多是抗生素的抗性基因,，不特指多位Ampr（試一試）。
無(wú)論選用哪種載體,，首先都要獲得載體分子,，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進(jìn)行切割，獲得分子,，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接,。
質(zhì)粒載體 質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的,，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分,。其特點(diǎn)如下： ①是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA）,，可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu),，不同質(zhì)粒大小在2-300kb之間,，＜15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，＞15kb的大質(zhì)粒則不易提取,。 ?、谀茏灾鲝?fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子（autonomous replicon）,。一般質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)?？呻S宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。按質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：嚴(yán)緊控制（stringent control）型質(zhì)粒的復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián),，拷貝數(shù)較少,，每個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)到十幾個(gè)拷貝；另一類是松弛控制（relaxed control）型質(zhì)粒,，其復(fù)制宿主不偶聯(lián),，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。每個(gè)質(zhì)粒DNA上都有復(fù)制的起點(diǎn),，只有ori能被宿主細(xì)胞復(fù)制蛋白質(zhì)識(shí)別的質(zhì)粒才能在該種細(xì)胞中復(fù)制,，不同質(zhì)粒復(fù)制控制狀況主要與復(fù)制起點(diǎn)的序列結(jié)構(gòu)相關(guān)。有的質(zhì)粒的可以整合到宿主細(xì)胞染色質(zhì)DNA中,，隨宿主DNA復(fù)制,，稱為附加體，例如細(xì)菌的性質(zhì)粒就是一種附加體,，它可以質(zhì)粒形式存在,，也能整合入細(xì)菌的DNA，又能從細(xì)菌染色質(zhì)DNA上切下來(lái),。F因子攜帶基因編碼的蛋白質(zhì)能使兩個(gè)細(xì)菌間形成纖毛狀細(xì)管連接的接合（conjugation）,，通過(guò)這細(xì)管遺傳物質(zhì)可在兩個(gè)細(xì)菌間傳遞。 ?、圪|(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的,。這點(diǎn)不同于線粒體，線粒體DNA也是環(huán)狀雙鏈分子,，也有獨(dú)立復(fù)制的調(diào)控,，但線粒體的功能是細(xì)胞生存所必需的。線粒體是細(xì)胞的一部分,，質(zhì)粒也往往有其表型,，其表現(xiàn)不是宿主生存所必需的，但也不妨礙宿主的生存,。某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存,，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因,，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素,、氯霉素,、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒,，又稱R質(zhì)粒,，帶有R質(zhì)粒的細(xì)菌就能在相應(yīng)的抗生素存在生存繁殖。所以質(zhì)粒對(duì)宿主不是寄生的,，而是共生的,。
